摘要
鼠疫耶尔森菌作为假结核耶尔森菌的一个克隆变体进化而来，通过跳蚤传播的、生物膜介导的方式引发腺鼠疫。LysR型转录调节因子RovM仅在鼠疫耶尔森菌感染跳蚤宿主期间被高度诱导。RovM在其他病原体中的同源物调节生物膜形成、营养感应和毒力；包括在假结核耶尔森菌中，RovM抑制主要毒力因子RovA。本研究通过使用缺失rovM的鼠疫耶尔森菌KIM6+菌株（ΔrovM）来调查RovM在跳蚤感染期间的作用。ΔrovM突变株在跳蚤单一感染中，其特有的生物膜肠道阻塞、生长或存活未受影响。
然而，在跳蚤共感染期间，与野生型菌株相比，ΔrovM突变株表现出显著的竞争适应性缺陷。这种竞争适应性缺陷在反式互补并过表达rovM的ΔrovM突变株中，相对于野生型恢复为适应性优势。与此一致的是，与野生型相比，产生更高RovM转录水平的鼠疫耶尔森菌菌株在响应特定营养物质时表现出更高的生长速率和差异化的生物膜形成能力。此外，我们证明在跳蚤体内rovA并未被RovM抑制，但在体外，rovM转录水平升高与特定营养条件下rovA的抑制相关。总的来说，这些发现表明RovM很可能感知跳蚤肠道环境中的特定营养线索，并相应地指导代谢适应以增强鼠疫耶尔森菌对跳蚤肠道的定植。
引言
引起腺鼠疫的杆菌——鼠疫耶尔森菌，可以通过在其跳蚤媒介的前胃形成坚固的生物膜而有效地传播给哺乳动物宿主。为了理解指导跳蚤体内生物膜阻塞的分子机制，先前已经对来自阻塞跳蚤的鼠疫耶尔森菌与在温度匹配的体外培养条件下生长的鼠疫耶尔森菌的转录反应进行了表征。观察到编码LysR型转录调节因子（LTTR）的rovM基因仅在跳蚤肠道中被高度上调。
LTTRs在原核生物中构成一个庞大的家族，调节涉及毒力、代谢、运动和群体感应的多种基因。鼠疫耶尔森菌的RovM蛋白与同源LTTRs（LrhA/HexS/PecT/HexA）共享超过65%的整体同一性，这些同源物在致病性大肠杆菌、沙雷氏菌属、欧文氏菌属以及昆虫病原体发光光杆菌和嗜线虫致病杆菌中调节生物膜形成、粘附素合成、胞外多糖、运动性、胞外酶和胞外脂质等基本毒力因子。然而，与昆虫病原体发光光杆菌和嗜线虫致病杆菌不同，鼠疫耶尔森菌对跳蚤无毒力。
Heroven等人确定，假结核耶尔森菌的RovM转录调节因子响应特定的环境营养线索，是一个关键的毒力调节因子，其蛋白水平升高会导致小鼠感染期间运动过度且无法传播到更深层组织。重要的是，假结核耶尔森菌的RovM能够调节rovA的活性，rovA编码另一个主要的毒力转录调节因子，间接控制肠道组织中的细胞侵袭。RovM蛋白能够在基本培养基中抑制rovA，这是通过全局代谢调节蛋白CsrA及其相关的调节性非编码RNA介导的。总的来说，RovA在调节毒力方面的作用已在假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌中得到明确界定。特别是在鼠疫耶尔森菌中，已证明RovA激活pH6抗原位点（psaEFABC），该位点负责合成和运输PsaA菌毛，以增强对巨噬细胞吞噬的抵抗力；并且RovA和PsaA在鼠疫腺鼠疫小鼠模型中都是完全毒力所必需的。与这些发现一致的是，rovM在跳蚤体内的上调伴随着rovA和psaE的显著下调。相反，在腺鼠疫期间，rovA上调超过5倍，而rovM下调。
鉴于RovM及其同源物在细菌致病性中的重要性，我们预测鼠疫耶尔森菌的RovM在调节生物膜形成、抑制rovA和/或其哺乳动物毒力调节子、和/或营养感应以增强鼠疫耶尔森菌对跳蚤宿主的感染方面具有保守作用。为了验证这一点，我们构建了鼠疫耶尔森菌KIM6+ΔrovM突变体，并在体外通过评估其生长、生物膜形成以及rovM和rovA转录的测定，以及在跳蚤肠道感染期间体内评估其生物膜介导的肠道阻塞和存活能力来表征其作用。我们的结果表明，转录调节因子RovM可以响应特定的营养线索（例如精氨酸）调节生物膜，但并不控制跳蚤肠道中rovA的表达。重要的是，RovM的表达似乎与营养感应和获取相关，并且对于鼠疫耶尔森菌有效适应跳蚤肠道环境至关重要。
材料与方法
细菌菌株、培养基和生长条件
本研究中使用的细菌菌株是鼠疫耶尔森菌KIM6+，该菌株缺乏编码T3SS的70-kb毒力质粒。所有生长研究均在约23°C下使用Bioscreen C摇床培养箱进行，并在所选研究培养基中进行连续的条件化生长步骤。在本研究中，除了丰富的复杂LB培养基外，还使用了两种用于鼠疫耶尔森菌特定培养的化学限定培养基。一种是称为TMH的复杂限定培养基，另一种是最低培养基，我们称之为Sebbane最低培养基（SMM）。这两种鼠疫耶尔森菌限定培养基都用作基础培养基，可以向其中添加新的碳源或氮源。TMH培养基促进鼠疫耶尔森菌的生物膜形成，并补充有0.2%半乳糖和1μg/mL血红素。也使用了不含精氨酸（arg）的TMH培养基。为简化参考，我们将补充了0.2%半乳糖和1μg/mL血红素、含或不含arg的TMH培养基分别称为TMH-gal+或TMH-gal+arg。
SMM培养基包含鼠疫耶尔森菌生长所需的基本代谢物，包括其营养缺陷的五种氨基酸（异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸）。对于生长研究以确定新营养物质对鼠疫耶尔森菌生长的影响，将SMM培养基补充以浓度为0.2%（w/v）的糖类：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖和N,N'-二乙酰壳二糖。或者，将SMM中通常不含的氨基酸：谷氨酰胺（gln）、精氨酸（arg）和组氨酸（his），按照它们在TMH培养基中的浓度（分别为100mM、24mM和2mM）补充到SMM中。生长研究进行了3-4次独立的生物学重复。生长速率使用指数生长期的线性回归分析计算。
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