4. 讨论
本研究的目的是评估从开菲尔粒中分离的开菲尔乳杆菌B6的益生菌和抗菌特性，并通过选择最佳益生元促进目标益生菌的生长并增强其抗菌活性来开发合生素。
有许多关于各种乳杆菌属在不同pH值下存活性的研究，但据我们所知，目前尚无专门关于开菲尔乳杆菌的数据。许多关于酸耐受性的研究使用不同的浓度、暴露期和模型设计，使得不同潜在益生菌菌株的酸耐受性比较困难。酸耐受性也显著受细胞培养条件和用于酸耐受性测定的收获生长阶段的影响。研究了鼠李糖乳杆菌菌株在pH 2和3下的存活，观察到2小时暴露后pH 3下活力损失约2-3 log cfu/mL，pH 2下4-7 log cfu/mL，取决于单个菌株。测试了20种乳杆菌菌株耐受pH 2.5 4小时的能力。观察到的活力损失范围为0.9至3.5 log cfu/mL。这些比较数据表明，本研究中使用的开菲尔乳杆菌B6菌株具有与其他乳酸菌相当的酸耐受性，但并非特别耐酸。这对潜在益生菌来说是一个缺点，但体外酸耐受性调查只能提供与摄入细菌培养物通过胃部存活能力相关的部分数据。一个重要考虑因素是细菌所消费的食品基质。一些食品成分，如脂肪，可以在通过胃部期间保护活细菌免受酸的影响。这种保护作用可以通过包埋技术的应用人为增强。
胆汁耐受性显示开菲尔乳杆菌B6对0.4%（w/v）Oxgall（~5.6 mM结合胆汁酸）具有抗性。该胆汁酸浓度高于小肠中通常发现的浓度（根据文献为2.8-4.0 mM），因此该分离物在体内不应受胆汁影响，除非其他协同因素（如消化酶）影响其敏感性。
在大多数情况下，用益生元化合物替代生长培养基中的葡萄糖通常不会影响细菌的生长速率。许多乳杆菌在缺乏碳水化合物的情况下生长不良，本研究中检查的菌株在不含碳水化合物的培养基中生长非常差或根本不生长（数据未显示）。这表明开菲尔乳杆菌B6能够代谢至少部分测试的碳水化合物。
应注意，所有添加的低聚糖化合物都含有一些作为杂质的单糖和二糖。在基于果糖的低聚糖Synergy 1和Raftilose P95的情况下，单糖/二糖（葡萄糖、果糖、蔗糖）含量在原料中<<10%，相当于培养基中<<0.1%。虽然这种浓度的简单糖会支持开菲尔乳杆菌B6的一些生长，如果它不能水解寡聚形式，但该生物在益生元上5小时后与1%葡萄糖上生长一样好的事实表明，开菲尔乳杆菌B6能够代谢低聚糖。GOS具有更高的简单糖含量，约40%主要是葡萄糖和乳糖，这种等效浓度的简单糖被证明支持开菲尔乳杆菌B6在单培养中的生长。
然而，当向PY肉汤中添加0.2%葡萄糖和0.2%乳糖（近似含1% GOS糖浆的肉汤简单糖组成）时，观察到开菲尔乳杆菌B6与单核细胞增生李斯特菌共培养中生长不良。这表明在含0.2%（w/v）葡萄糖和0.2%（w/v）乳糖的共培养中，开菲尔乳杆菌B6可能无法与单核细胞增生李斯特菌竞争有限的可利用糖，但能够在图3B中代谢GOS。文献中缺乏开菲尔乳杆菌在GOS上生长的数据。它被列为半乳糖阴性，但本研究中使用的菌株被证明在半乳糖上生长，从而满足GOS生长要求之一。
乳果糖由制造商指定为>98%纯度，因此其他碳水化合物仅以非常低的水平存在，不太可能影响细菌的生长。单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌通常通过在不含碳水化合物的培养基上代谢蛋白胨和其他有机成分而容易生长。因此，利用测试碳水化合物的能力可能在很大程度上被掩盖。
开菲尔乳杆菌B6与单核细胞增生李斯特菌或大肠杆菌的共培养产酸根据添加的碳水化合物来源而异。与两种基于果糖的低聚糖（Synergy 1和Raftilose P95）的共培养中最终pH高于GOS和乳果糖的共培养。影响pH变化的因素可能包括共培养培养基中两种细菌可发酵的碳水化合物量和产生的酸混合物组成。开菲尔乳杆菌是异型发酵的，但关于其碳水化合物来源发酵谱的数据不可用。然而，在另一项异型发酵乳杆菌的实验中，观察到当在果糖上生长时，发酵乳杆菌产生的乳酸少于在葡萄糖或蔗糖上生长时。也产生乙酸，但这是较弱的酸（pKa 4.76，乳酸为3.86），在乳酸存在下不太可能显著影响pH。
相反，观察到鼠李糖乳杆菌在葡萄糖和果糖上生长时产酸最大，蔗糖和乳糖及半乳糖显著较少。碳水化合物来源对开菲尔乳杆菌B6发酵产物的类似影响可能部分解释本工作中观察到的pH差异。共培养中的其他细菌（单核细胞增生李斯特菌或大肠杆菌）也从碳水化合物发酵产生酸。单核细胞增生李斯特菌主要产生乳酸或乙酸和乳酸的混合物，取决于氧的可用性，而大肠杆菌产生乙酸、甲酸和乳酸。
与开菲尔乳杆菌B6共培养对单核细胞增生李斯特菌生长的抑制效果在使用Synergy 1、乳果糖和Raftilose P95作为添加碳水化合物来源时边缘显著或不存在。然而，使用GOS时观察到单核细胞增生李斯特菌活力的非常显著的下降。pH到12小时降至约5.0，这一水平可能抑制单核细胞增生李斯特菌的生长：使用HCl而非有机酸时，单核细胞增生李斯特菌生长的下限pH约为4.5。然而，观察到的pH降低和相关有机酸产生不太可能单独足以导致观察到的活力损失。使用乳果糖时未观察到类似效果，即使酸化谱非常相似（尽管酸的组成可能不同）。研究了乳酸和乙酸中较低pH（4.0）下单核细胞增生李斯特菌的存活。在这两种情况下，需要七天储存才能观察到本研究中24小时内观察到的数量下降幅度。
数据表明有机酸以外的抗菌因子在共培养中活跃。一种可能的化合物是kefiran，一种由开菲尔乳杆菌、开菲尔乳杆菌kefiranofaciens和开菲尔中发现的少量其他细菌产生的半乳糖和葡萄糖多糖。Kefiran是一种抗菌物质，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有活性，可破坏细胞膜的完整性。开菲尔乳杆菌未被报道产生细菌素。
虽然报道了 kefiran 对大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的类似敏感性，但这可能不适用于两种细菌的所有菌株，本研究中仅观察到对单核细胞增生李斯特菌的抗菌效果可能是由于所用单个菌株的敏感性差异。仅当GOS添加到培养基中时才观察到主要抑制效果，而非乳果糖或基于FOS的低聚糖。生长底物可以强烈影响微生物产生的外多糖。在kefiran的情况下，据报道向生长培养基中添加乳糖（5%）显著促进开菲尔粒中细菌混合培养的kefiran产生。在本研究中，GOS糖浆是唯一含有游离乳糖的益生元化合物，尽管最终浓度0.2%远低于文献中使用的浓度。这些作者推测乳糖被细菌用作kefiran生物合成的半乳糖来源。GOS的水解会产生半乳糖，GOS糖浆还含有游离半乳糖，可以进一步促进kefiran生物合成，尽管最终浓度非常低（0.01%）。
抗菌化合物如kefiran负责或部分负责抗菌活性的假设未得到培养滤液实验结果的支持（图4），因为当上清液pH中和时抑制效果消失。然而，滤液以其原始浓度的40%存在，因此任何特定的抗菌活性可能被稀释掉。在中性滤液存在下最大细胞密度明显增加的原因尚不清楚。可能是滤液中氢氧化钠和有机酸盐的存在增加了培养基的缓冲能力，这延迟了单核细胞增生李斯特菌培养被其自身酸性代谢废物产物抑制的时间点。滤液还可能含有开菲尔乳杆菌B6从PY培养基中释放的限制性营养物质，并使其可供单核细胞增生李斯特菌利用。
单核细胞增生李斯特菌的活力在纯培养中用GOS生长时也开始下降，尽管程度远小于共培养。这在早期生长实验中未观察到，但由于早期实验中通过浊度法测定生长，细胞的任何活力损失不会立即显现。使用乳果糖的培养中也观察到类似但较不明显的活力下降。24小时内这种活力损失的原因尚不清楚。可能是乳果糖和GOS（或其单糖/二糖污染物）容易被生长培养物发酵，导致代谢废物产物快速积累，而基于FOS的化合物发酵较慢。
大肠杆菌不受与开菲尔乳杆菌B6和益生元化合物共培养的影响，除使用乳果糖培养时在一个时间点存在小差异外。大肠杆菌对酸性条件相当耐受：在没有乳酸的情况下，pH约4.5时生长速率显著降低（但未停止），在100 mM乳酸存在下升至约pH 5.5。在本研究中，pH直到至少8小时孵育后才降至6以下，此时大肠杆菌已进入稳定期。
5. 结论
这些结果表明，开菲尔乳杆菌B6具有作为益生菌的潜力，因为它耐受胆汁并显示抗病原体活性，尽管后者似乎具有底物特异性。该菌株的耐酸性低于理想潜在益生菌的水平，但耐酸性可以通过包埋技术的应用或食品载体的仔细配方来增强。该生物在多种益生元上生长良好，这有助于开发合生素产品。
致谢
作者希望感谢以下公司：比利时Beneo-Orafti公司 kindly 提供Raftilose®P95和Synergy 1，荷兰FrieslandCampina Domo公司 kindly 提供Vivinal®GOS。部分研究作为M.Sc.论文（Paraskevi Valavani）进行，属于塞萨洛尼基亚历山大技术教育学院食品技术系运行的"食品工业质量管理和生产组织系统理学硕士"项目。
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