2.4. 经银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）处理的四种细菌的形态学改变
观察四种细菌菌株暴露于银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）后形态结构改变的方法与先前研究中描述的相同并稍作修改。银的实验浓度（mg/mL）均为0（对照）和2。四种细菌的浓度各为10⁸ CFU/mL。培养物在37°C、150 rpm水浴摇床中培养5小时。然后，对细菌细胞进行取样并制备用于TEM（日立H-7650）观察。实验进行三个重复。
3. 结果与讨论
3.1. 银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的抗菌活性
通过毒饵技术测定的银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的MIC显示在表1中。培养2天后，对照平板上长满大肠杆菌菌落，而在0.125和0.25 mg/mL银离子的实验组中仅观察到数十个菌落，在0.5-8 mg/mL银离子组中未观察到菌落。培养2天后，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌落长满对照、0.125、0.25和0.5 mg/mL银离子的实验平板，而在1-8 mg/mL银离子组中未观察到菌落。因此，银离子对大肠杆菌的MIC为0.5 mg/mL，对其他三种菌株为1 mg/mL。这表明银离子具有强抗菌活性。然而，AgNPs（I）对大肠杆菌的MIC为1 mg/mL，对其他所有菌株为2 mg/mL。AgNPs（II）对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的MIC为2 mg/mL，对金黄色葡萄球菌为4 mg/mL，对铜绿假单胞菌为8 mg/mL。因此，毒饵技术测定的实验结果表明，银离子的抗菌活性始终强于AgNPs（I）和AgNPs（II）。三组银之间抗菌活性的差异小于4倍。
表1 银离子和AgNPs对选定微生物的最低抑制浓度
| 银浓度 (mg/mL) | 大肠杆菌ATCC 8739_银离子 | 大肠杆菌ATCC 8739_AgNPs I | 大肠杆菌ATCC 8739_AgNPs II | 铜绿假单胞菌ATCC 9027_银离子 | 铜绿假单胞菌ATCC 9027_AgNPs I | 铜绿假单胞菌ATCC 9027_AgNPs II | 金黄色葡萄球菌ATCC 6538_银离子 | 金黄色葡萄球菌ATCC 6538_AgNPs I | 金黄色葡萄球菌ATCC 6538_AgNPs II | 表皮葡萄球菌ATCC 12228_银离子 | 表皮葡萄球菌ATCC 12228_AgNPs I | 表皮葡萄球菌ATCC 12228_AgNPs II |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.125 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 0.250 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 0.500 | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 1.000 | - | - | + | - | + | + | - | + | + | - | + | + |
| 2.000 | - | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | + |
| 4.000 | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | + |
| 8.000 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
注：+ 表示生长，- 表示无生长
3.2. 银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的抗菌动力学
银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对四种细菌菌株的抗菌动态曲线显示在图2（大肠杆菌）、图3（铜绿假单胞菌）、图4（金黄色葡萄球菌）和图5（表皮葡萄球菌）中。四种细菌在对照中的生长动态趋势是典型的生长曲线，包括延迟期、指数期、稳定期和衰亡期。
图2. 银离子（A）、AgNPs（I）（B）和AgNPs（II）（C）对大肠杆菌的抗菌动态曲线。
图3. 银离子（A）、AgNPs（I）（B）和AgNPs（II）（C）对铜绿假单胞菌的抗菌动态曲线。
图4. 银离子（A）、AgNPs（I）（B）和AgNPs（II）（C）对金黄色葡萄球菌的抗菌动态曲线。
图5. 银离子（A）、AgNPs（I）（B）和AgNPs（II）（C）对表皮葡萄球菌的抗菌动态曲线。
银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对大肠杆菌的抗菌动态曲线显示，AgNPs（I）对大肠杆菌的抗菌动力学强于AgNPs（II）和银离子。三种类型中低浓度的银均延长了大肠杆菌的生长延迟期。0.5 mg/mL的AgNPs（I）能完全抑制大肠杆菌的生长。1.0 mg/mL的银离子可发挥相同的抑制效果。0.5或2.0 mg/mL的AgNPs（II）能基本或完全抑制大肠杆菌的生长。
银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对铜绿假单胞菌的抗菌动态曲线显示，银离子对铜绿假单胞菌的抗菌动力学强于AgNPs（I）和AgNPs（II）。0.25 mg/mL的银离子可延长铜绿假单胞菌的生长延迟期，0.5 mg/mL能完全抑制细菌生长。然而，2.0 mg/mL AgNPs（I）或4.0 mg/mL AgNPs（II）发挥相同的抗菌效果。
银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对金黄色葡萄球菌的抗菌动态曲线显示，AgNPs（I）对金黄色葡萄球菌的抗菌动力学强于AgNPs（II）和银离子。1.0 mg/mL的AgNPs（I）能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，2.0 mg/mL的AgNPs（II）或4.0 mg/mL的银离子可发挥相同的抗菌效果。
银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对表皮葡萄球菌的抗菌动态曲线显示，银离子对表皮葡萄球菌的抗菌动力学强于AgNPs（I）和AgNPs（II）。0.5 mg/mL的银离子可将表皮葡萄球菌的延迟期延长至约50小时，而相同浓度的AgNPs（I）可延长至约30小时。1.0 mg/mL的银离子和AgNPs（I）均能完全抑制表皮葡萄球菌的生长。然而，4.0 mg/mL的AgNPs（II）可发挥相同的抗菌效果。
抗菌动力学的实验结果表明，三组银之间抗菌活性的差异小于4倍。AgNPs（I）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌动力学强于AgNPs（II）和银离子，而银离子对铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的抗菌动力学强于AgNPs（I）和AgNPs（II）。AgNPs（I）的抗菌动力学始终优于AgNPs（II）。
3.3. 暴露于银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的细菌形态学改变
通过TEM观察暴露于银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的四种细菌菌株结构改变的照片显示在图6中。
大肠杆菌（图6-A1）和铜绿假单胞菌（图6-B1）的对照细胞均显示杆状细菌的特征。它们的细胞表面光滑完整。此外，大肠杆菌的周生鞭毛和铜绿假单胞菌的单端鞭毛清晰可见。同样，金黄色葡萄球菌（图6-C1）和表皮葡萄球菌（图6-D1）的对照细胞均显示典型的球菌形态。它们的细胞表面也光滑完整。
相反，暴露于2 mg/mL银离子5小时后，大肠杆菌（图6-A2）、铜绿假单胞菌（图6-B2）、金黄色葡萄球菌（图6-C2）和表皮葡萄球菌（图6-D2）细胞均显示明显改变。细胞已变形。细胞壁受损，细胞表面显示许多孔洞和间隙。此外，大肠杆菌和铜绿假单胞菌的鞭毛已消失。暴露于银离子5小时后，四种细菌菌株的细胞被严重破坏。
与银离子暴露类似，四种细菌物种的细胞形态在暴露于AgNPs（I）（图6-A3、B3、C3、D3）和AgNPs（II）（图6-A4、B4、C4、D4）后发生不可逆改变。银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）暴露之间细胞形态改变未发现显著差异。这一发现表明银离子的作用模式与AgNPs相似，与先前的报告一致。也有报道指出AgNPs的作用模式与银离子相似。
TEM观察表明，所有银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）均能在细菌细胞中诱导严重损伤。细菌的鞭毛受损甚至被消除，这将导致运动障碍。在细胞表面观察到许多孔洞或间隙，这将导致细胞质和大分子泄漏，并最终导致细胞死亡。
图6. 透射电子显微镜观察暴露于银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）的四种细菌菌株的细胞结构改变。（A1）至（D1）显示对照大肠杆菌（A1）、铜绿假单胞菌（B1）、金黄色葡萄球菌（C1）和表皮葡萄球菌（D1）细胞的正常细胞结构；（A2）至（D2）显示暴露于银离子5小时后大肠杆菌（A2）、铜绿假单胞菌（B2）、金黄色葡萄球菌（C2）和表皮葡萄球菌（D2）的结构改变；（A3）至（D3）显示暴露于AgNPs（I）5小时后大肠杆菌（A3）、铜绿假单胞菌（B3）、金黄色葡萄球菌（C3）和表皮葡萄球菌（D3）的结构改变；（A4）至（D4）显示暴露于AgNPs（II）5小时后大肠杆菌（A4）、铜绿假单胞菌（B4）、金黄色葡萄球菌（C4）和表皮葡萄球菌（D4）的结构改变。
4. 结论
总之，银离子具有强抗菌活性，优于AgNPs（I）和AgNPs（II）。银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）对大肠杆菌的MIC分别为0.5、1和2 mg/mL，对铜绿假单胞菌为1、2和8 mg/mL，对金黄色葡萄球菌为1、2和4 mg/mL，对表皮葡萄球菌为1、2和2 mg/mL。此外，所有银离子、AgNPs（I）和AgNPs（II）均具有良好的抗菌动力学。它们能以浓度依赖方式延长细菌的生长延迟期。实验结果表明三组银之间抗菌活性的差异小于4倍。此外，银离子和AgNPs能在细胞结构中诱导不可逆改变，如受损的鞭毛，以及细胞表面可导致运动障碍和细胞死亡的孔洞和间隙。银离子的作用模式与AgNPs相似。因此，银离子和AgNPs不仅具有广谱抗菌应用的潜力，而且是非常有前景的抗菌剂。
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