1.6测序和序列分析


将PCR产物阳性条带切胶回收纯化(胶回收试剂盒),连接至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过菌液PCR筛选阳性克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。


1.7生化试验


参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版),使用细菌微量生化鉴定管进行测试:


葡萄糖发酵试验


乳糖发酵试验


精氨酸水解试验


明胶液化试验


尿素酶试验


甘露醇发酵试验


操作方法:


葡萄糖、乳糖、精氨酸、甘露醇鉴定管:加入100μL M.bovis菌悬液(约10⁷CCU/mL),37℃培养3天。


明胶液化鉴定管:加入M.bovis菌悬液,37℃培养3天后置4℃冰箱30 min观察。


尿素酶试验:用无菌接种针挑取菌落穿刺接种,37℃培养3天。


结果判定依据试剂盒说明书进行。


1.8生长曲线绘制


取培养至对数中期的二级种子液,按2.5%(V/V)的接种量接种于新鲜PPLO液体培养基(含20%马血清),置37℃恒温摇床(120 rpm)培养。在接种后0,3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60 h取样,立即进行颜色变化单位(Colour Change Unit,CCU)测定。每次取样设置3个平行。


CCU测定方法(改进版):取12支装有0.9 mL PPLO液体培养基的试管。在第1管中加入0.1 mL待测样品,混匀。吸取0.1 mL此混合液至第2管,混匀。依此类推,进行10倍系列稀释至第11管(第11管弃去0.1 mL)。第12管不接种作为阴性对照。所有试管置37℃静置培养。每日观察并记录管中培养基由红变黄的终点。以发生颜色变化的最高稀释度(即终点管)计算CCU。例如:第1至第8管变色,第9、10管未变色,则原样品的CCU为1×10⁸CCU/mL。每个样品测定3次,计算LOG CCU/mL(以10为底),绘制生长曲线。


1.9致病性试验


试验动物:选择4头2~3月龄的健康断奶犊牛(经临床检查及鼻拭子PCR检测确认无M.bovis感染)。


分组与处理:随机分为2组,每组2头。感染组:通过气管注射方式接种10 mL M.bovis YJ-22菌悬液(浓度1×10¹⁰CCU/mL,悬浮于PPLO培养基),连续攻毒3天(每天一次)。对照组:气管注射10 mL无菌PPLO液体培养基,操作同感染组。


临床观察:攻毒前3天至攻毒后21天,每日观察并记录牛只的体温(每日上午固定时间)、精神状态、呼吸频率与深度、咳嗽(频率、严重程度)、关节肿胀情况、鼻腔分泌物(性质、量)等临床症状。


排菌检测:分别在攻毒前(0d)、攻毒后第1,2,3,4,7,10,13,16,19,22 d采集所有试验牛的鼻拭子。鼻拭子样品用于病原分离培养及PCR鉴定。


病理学检查:攻毒21 d后,对所有试验牛实施安乐死并进行剖检。观察肺部及其他组织器官的大体病变,重点记录肺部损伤情况,参照Maunsell等描述的病变判分标准进行肺部病变评分(Gross lung lesion scores)。取有代表性的肺组织(病变区及交界区)浸泡于4%多聚甲醛中固定,送武汉赛维尔生物科技有限公司制作石蜡切片,进行H&E染色。光镜下观察肺组织病理学变化。


1.10免疫原性验证试验


疫苗制备:将M.bovis YJ-22分离株接种于PPLO液体培养基,37℃培养30 h(达平台期),测定菌液浓度为1×10⁹CCU/mL。8000×g离心20 min收集菌体,用无菌PBS(pH 7.2)洗涤3次。用含2 mmol/L二乙烯亚胺(Binary Ethyleneimine,BEI)的PBS悬浮菌体至原体积,37℃灭活24 h。灭活后与201油乳佐剂按55:45(V/V)的比例乳化,制成灭活疫苗。


动物免疫:选用10只体重约1.5 kg的雄性健康新西兰白兔(血清学检测M.bovis抗体阴性),随机分为2组,每组5只。


免疫组:颈部皮下注射制备的YJ-22灭活疫苗1 mL。


阴性对照组:颈部皮下注射无菌生理盐水1 mL。


21 d后,按相同途径和剂量进行加强免疫。


抗体检测:二免后14 d,心脏采血,分离血清。


ELISA抗原:用YJ-22全菌经超声破碎处理后作为包被抗原(最佳条件需优化)。


ELISA检测:采用间接ELISA法。将抗原包被酶标板(4℃过夜),封闭后,将待检兔血清进行2倍比稀释(1:2至1:256),加入孔中孵育,洗涤后加入HRP标记的抗兔IgG二抗孵育,最后加入TMB底物显色,H₂SO₄终止,读取OD450nm值。


效价判定:以阴性对照平均OD值+3倍标准差作为临界值(Cut-off)。血清抗体的终点效价定义为产生大于或等于Cut-off值的最高稀释度的倒数(≥Cut-off值)。


1.11兔抗血清体外杀菌试验


血清处理:取高免的M.bovis阳性兔血清(来自免疫原性试验中抗体效价≥1:64的兔)及阴性兔血清,56℃水浴30 min灭活补体,随后经0.22μm滤膜除菌。


菌液准备:将M.bovis YJ-22分离株37℃培养30 h,用无菌PPLO液体培养基进行10倍系列稀释5个梯度(10⁰,10⁻¹,10⁻²,10⁻³,10⁻⁴,约为1×10⁹~1×10⁵CCU/mL)。


杀菌处理:将每个稀释度的菌液分别与处理后的阳性兔血清或阴性兔血清按1:1(V/V)比例混合(例如:100μL菌液+100μL血清),轻轻混匀。


孵育:37℃孵育2小时。


CCU测定:孵育结束后,立即对每个混合样品(菌+阳性血清或菌+阴性血清)进行CCU测定(方法同1.8)。


存活率计算:M.bovis存活率(%)=(经阳性兔血清处理后样品测得的CCU/经阴性兔血清处理后样品测得的CCU)×100%。对每个稀释度的结果分别计算存活率。试验重复3次。


1.12统计学分析


实验数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析和绘图。CCU测定结果取LOG值表示。结果以平均值±标准差表示。致病性研究中体温变化采用时间序列图展示。抗体效价描述抗体分布情况。杀菌试验存活率数据结合图表描述。


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