1.6测序和序列分析
将PCR产物阳性条带切胶回收纯化（胶回收试剂盒），连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过菌液PCR筛选阳性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。
1.7生化试验
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版），使用细菌微量生化鉴定管进行测试：
葡萄糖发酵试验
乳糖发酵试验
精氨酸水解试验
明胶液化试验
尿素酶试验
甘露醇发酵试验
操作方法：
葡萄糖、乳糖、精氨酸、甘露醇鉴定管：加入100μL M.bovis菌悬液（约10⁷CCU/mL），37℃培养3天。
明胶液化鉴定管：加入M.bovis菌悬液，37℃培养3天后置4℃冰箱30 min观察。
尿素酶试验：用无菌接种针挑取菌落穿刺接种，37℃培养3天。
结果判定依据试剂盒说明书进行。
1.8生长曲线绘制
取培养至对数中期的二级种子液，按2.5%(V/V)的接种量接种于新鲜PPLO液体培养基（含20%马血清），置37℃恒温摇床（120 rpm）培养。在接种后0,3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60 h取样，立即进行颜色变化单位（Colour Change Unit,CCU）测定。每次取样设置3个平行。
CCU测定方法（改进版）：取12支装有0.9 mL PPLO液体培养基的试管。在第1管中加入0.1 mL待测样品，混匀。吸取0.1 mL此混合液至第2管，混匀。依此类推，进行10倍系列稀释至第11管（第11管弃去0.1 mL）。第12管不接种作为阴性对照。所有试管置37℃静置培养。每日观察并记录管中培养基由红变黄的终点。以发生颜色变化的最高稀释度（即终点管）计算CCU。例如：第1至第8管变色，第9、10管未变色，则原样品的CCU为1×10⁸CCU/mL。每个样品测定3次，计算LOG CCU/mL（以10为底），绘制生长曲线。
1.9致病性试验
试验动物：选择4头2~3月龄的健康断奶犊牛（经临床检查及鼻拭子PCR检测确认无M.bovis感染）。
分组与处理：随机分为2组，每组2头。感染组：通过气管注射方式接种10 mL M.bovis YJ-22菌悬液（浓度1×10¹⁰CCU/mL，悬浮于PPLO培养基），连续攻毒3天（每天一次）。对照组：气管注射10 mL无菌PPLO液体培养基，操作同感染组。
临床观察：攻毒前3天至攻毒后21天，每日观察并记录牛只的体温（每日上午固定时间）、精神状态、呼吸频率与深度、咳嗽（频率、严重程度）、关节肿胀情况、鼻腔分泌物（性质、量）等临床症状。
排菌检测：分别在攻毒前（0d）、攻毒后第1,2,3,4,7,10,13,16,19,22 d采集所有试验牛的鼻拭子。鼻拭子样品用于病原分离培养及PCR鉴定。
病理学检查：攻毒21 d后，对所有试验牛实施安乐死并进行剖检。观察肺部及其他组织器官的大体病变，重点记录肺部损伤情况，参照Maunsell等描述的病变判分标准进行肺部病变评分（Gross lung lesion scores）。取有代表性的肺组织（病变区及交界区）浸泡于4%多聚甲醛中固定，送武汉赛维尔生物科技有限公司制作石蜡切片，进行H&E染色。光镜下观察肺组织病理学变化。
1.10免疫原性验证试验
疫苗制备：将M.bovis YJ-22分离株接种于PPLO液体培养基，37℃培养30 h（达平台期），测定菌液浓度为1×10⁹CCU/mL。8000×g离心20 min收集菌体，用无菌PBS(pH 7.2)洗涤3次。用含2 mmol/L二乙烯亚胺（Binary Ethyleneimine,BEI）的PBS悬浮菌体至原体积，37℃灭活24 h。灭活后与201油乳佐剂按55:45(V/V)的比例乳化，制成灭活疫苗。
动物免疫：选用10只体重约1.5 kg的雄性健康新西兰白兔（血清学检测M.bovis抗体阴性），随机分为2组，每组5只。
免疫组：颈部皮下注射制备的YJ-22灭活疫苗1 mL。
阴性对照组：颈部皮下注射无菌生理盐水1 mL。
21 d后，按相同途径和剂量进行加强免疫。
抗体检测：二免后14 d，心脏采血，分离血清。
ELISA抗原：用YJ-22全菌经超声破碎处理后作为包被抗原（最佳条件需优化）。
ELISA检测：采用间接ELISA法。将抗原包被酶标板（4℃过夜），封闭后，将待检兔血清进行2倍比稀释（1:2至1:256），加入孔中孵育，洗涤后加入HRP标记的抗兔IgG二抗孵育，最后加入TMB底物显色，H₂SO₄终止，读取OD450nm值。
效价判定：以阴性对照平均OD值+3倍标准差作为临界值（Cut-off）。血清抗体的终点效价定义为产生大于或等于Cut-off值的最高稀释度的倒数（≥Cut-off值）。
1.11兔抗血清体外杀菌试验
血清处理：取高免的M.bovis阳性兔血清（来自免疫原性试验中抗体效价≥1:64的兔）及阴性兔血清，56℃水浴30 min灭活补体，随后经0.22μm滤膜除菌。
菌液准备：将M.bovis YJ-22分离株37℃培养30 h，用无菌PPLO液体培养基进行10倍系列稀释5个梯度（10⁰,10⁻¹,10⁻²,10⁻³,10⁻⁴，约为1×10⁹~1×10⁵CCU/mL）。
杀菌处理：将每个稀释度的菌液分别与处理后的阳性兔血清或阴性兔血清按1:1(V/V)比例混合（例如：100μL菌液+100μL血清），轻轻混匀。
孵育：37℃孵育2小时。
CCU测定：孵育结束后，立即对每个混合样品（菌+阳性血清或菌+阴性血清）进行CCU测定（方法同1.8）。
存活率计算：M.bovis存活率(%)=(经阳性兔血清处理后样品测得的CCU/经阴性兔血清处理后样品测得的CCU)×100%。对每个稀释度的结果分别计算存活率。试验重复3次。
1.12统计学分析
实验数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析和绘图。CCU测定结果取LOG值表示。结果以平均值±标准差表示。致病性研究中体温变化采用时间序列图展示。抗体效价描述抗体分布情况。杀菌试验存活率数据结合图表描述。
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