讨论
乳酸乳球菌IL1403的claR基因产物属于RpiR家族的潜在调控因子，该家族成员在许多其他相关或远缘细菌属中大量存在（http://www.kegg.jp/kegg/ssdb/）。最强的ClaR直系同源物仅在其他乳酸球菌物种中发现（例如，乳酸乳球菌亚种cremoris MG1363和SK11，以及乳酸乳球菌亚种lactis KF147）。在乳酸乳球菌IL1403基因组中编码了八个来自RpiR家族的旁系同源物（由yidA、yecA、yljC、yfeA、yugA、gntR和yleF编码），其中ClaR是原型例子。迄今为止，尚未将功能分配给乳酸乳球菌中任何RpiR家族基因。
然而，在许多不同细菌物种中发现的ClaR直系同源物的保守性表明在宿主生物中具有重要作用。实际上，已显示RpiR家族的少数成员作为参与不同碳源代谢的基因的正向或负向转录调控因子发挥作用。例如，在枯草芽孢杆菌中，麦芽糖代谢受到GlvR的正向调控。到目前为止，GlvR是革兰氏阳性细菌组中表征的RpiR调控因子家族的唯一代表。所有其他功能表征的例子都来源于革兰氏阴性细菌，其中RpiR家族调控因子似乎下调基因表达。这些RpiR样阻遏物已被证明在大肠杆菌中调控核糖和N-乙酰muramic acid的代谢，在恶臭假单胞菌中调控葡萄糖代谢，以及在柄杆菌、肠道沙门氏菌和苜蓿中华根瘤菌中调控肌醇代谢。RpiR家族成员在其N端包含一个HTH基序，在其C端包含一个SIS结构域。SIS结构域是在许多调控磷酸糖合成基因表达的蛋白质中发现的磷酸糖结合结构域。
有理由推测这种类型的调控在乳酸乳球菌IL1403中起作用；理论上，通过CelB进入IL1403细胞后磷酸化的纤维二糖或乳糖与ClaR的SIS结构域结合。这种结合可能导致ClaR调控因子的刺激，并允许其结合到相应的DNA区域，从而导致ClaR依赖的基因表达调控。我们假设通过这种机制，在纤维二糖或乳糖存在下，可以激活bglS、celB和ptcBA的表达。证实这一假设的证据包括观察到在纤维二糖存在下，claR突变体生长时，由于ClaR缺失，bglS、celB以及较小程度的ptcBA mRNA水平显著降低（表2）。当半乳糖或葡萄糖作为唯一碳源存在时，未观察到这种效应，表明这些糖对ClaR没有激活作用。
此外，ClaR在乳糖和纤维二糖代谢中起作用的假设得到了claR突变体在纤维二糖和/或乳糖补充培养基中生长缺陷的有力证实（图2a-c）。在IL1403△ccpA△claR菌株中缺失ccpA导致其在纤维二糖补充培养基中的生长部分恢复，但在乳糖补充培养基中则没有（图2a-c）。因此，可以合理地得出结论，由于缺乏bglS和celB的转录，这两种突变体几乎或完全不能利用这些糖，而bglS和celB的转录是PTSCel-Lac功能所必需的。
当通过表型微阵列和API 50CH测试进行全局评估时，在测试的数十种不同碳源中，未检测到claR缺失菌株与亲本菌株之间的进一步表型差异，这证实了ClaR的狭窄但显著的特异性。IL1403△claR在纤维二糖上几乎无法生长（图2a），同时在该糖上能有效呼吸（当通过表型微阵列测试时），这种矛盾现象可以通过IL1403中纤维二糖代谢的命运来解释。先前，我们表明EIIC CelB通透酶是乳酸乳球菌IL1403中纤维二糖和乳糖摄取的唯一专用蛋白，而BglS是乳糖水解的关键糖苷酶。尽管纤维二糖也是BglS的底物，但推测IL1403中可能存在一种或多种能够水解这种糖的额外酶，并且可能受到CcpA介导的负调控。此外，本研究的结果清楚地表明，bglS的转录紧密依赖于ClaR的激活，而celB的转录在较小程度上依赖于ClaR的激活（表2）。因此，我们可以假设在IL1403△claR中，仍然存在少量CelB，可能转运痕量的乳糖或纤维二糖。在IL1403△claR中内化的乳糖由于缺乏BglS（由ClaR缺失导致）不能作为能源。另一方面，在IL1403△claR中，通过CelB摄取纤维二糖以及不同于BglS的水解酶活性形成的纤维二糖衍生代谢物量很少，不足以进行有效的突变体细胞分裂，导致突变体生长受限。
本研究通过RT-qPCR确定的结果表明，在所有测试条件下（在不同糖存在下[表2]以及在CcpA蛋白存在或缺失下[数据未显示]），claR均以低水平弱表达，其相对基因表达水平仅略高于零。这与许多转录调控因子内源性以低量存在的事实一致，就ClaR而言，这可能是由于几个原因。首先，在claR基因上游发现的两个推定启动子与-10和-35序列的共有位点均显示不完全相关性，因此可能驱动低水平转录。其次，这些推定启动子之一产生的转录本起始于rho非依赖型终止子序列上游（图1b，c），这可能过早终止claR转录。我们证明它是一个中等强度的终止子，因为它以约60%的效率阻止了claR的转录。因此，可以假设覆盖claR基因的全长转录本的生成可能是通过少量通读转录实现的。然而，我们不能排除未知抗终止因子影响下通读终止效率可能增强的可能性。
尽管ClaR在糖代谢背景下的特异性狭窄，但其调控的基因在乳酸乳球菌菌株栖息的生态系统——植物材料（纤维二糖）和乳汁（乳糖）——中非常重要。拥有这样的调控因子允许其定居更多样化的环境，从而赋予乳酸乳球菌相对于其他微生物的优势。ClaR蛋白前所未有的作用使其更加重要，因为乳糖和β-葡萄糖苷的代谢对于涉及乳酸乳球菌的生物技术过程具有巨大的经济重要性，涉及发酵乳制品和植物产品的生产。获得与乳酸乳球菌中糖代谢及相关基因表达调控相关的详细知识可能有助于改进控制这些细菌中重要细胞过程的机制。对于像乳酸乳球菌这样的工业微生物，修改明确的调控网络可能会 drastically 影响细菌的特性并对生物过程产生影响。最后，我们可以假设通过我们的研究，我们可以引入乳酸球菌菌株代谢潜力的变化，这些菌株本身不能同化乳糖。我们可以通过失活ccpA或通过添加纤维二糖激活其他基因来启动这一过程。与质粒定位的lac操纵子相反，编码PTSCel-Lac组分的基因位于染色体上，这确保了它们的稳定性，这是工业应用的一个潜在重要特征。
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