3. 结果与讨论
3.1. 重金属对供体和受体细菌生长的抑制
在六种重金属五种不同浓度的条件下，微生物生长实验同时在Bioscreen C上进行。供体细菌和受体细菌的生长受到不同程度的重金属抑制。较低浓度的重金属，例如0.1 mmol/L铜（II）、0.1 mmol/L锌（II）、0.01 mmol/L镉（II）和0.5 mmol/L铅（II），可以显著抑制大肠杆菌MG1655和活性污泥细菌。最大生物量和生长速率随重金属浓度增加而降低。当浓度较高时，出现显著的延迟生长现象。延迟期约为12小时甚至更长。
根据用MATLAB拟合的生长曲线计算了测试重金属对供体大肠杆菌MG1655和受体细菌的IC50（表1）。可以发现大肠杆菌MG1655的IC50低于污泥细菌，后者具有高丰度的细菌，导致对重金属的抗性。
表1 合成废水中供体和受体的IC50值
| 金属 | IC50 (mmol/L) | |
|---|---|---|
| 供体 | 受体 | |
| 铜(II) | 0.6 | 0.93 |
| 锌(II) | 0.55 | 1.21 |
| 镉(II) | 0.07 | 0.35 |
| 铅(II) | 1.25 | 1.37 |
| 砷(V) | 0.76 | 1.43 |
| 汞(II) | 0.01 | 0.083 |
3.2. 筛选促进污泥细菌群落中ARG转移的重金属
如生长抑制实验所示，自动生长曲线分析仪代替传统摇瓶，快速准确地同时预测了不同浓度重金属对细菌生长的影响。因此，为了快速筛选促进ARG转移的重金属，接合实验与抑制实验一样进行。接合实验中应用的重金属浓度梯度由IC50值确定，混合供体和受体细菌的生长曲线显示在补充图S3中。
接合实验后，通过流式细胞术分析细菌细胞，如图1所示。门控阈值基于对照样品（包括RFP阳性供体和GFP阴性受体）的读数设定。随着重金属浓度增加，供体菌株受到重金属抑制，表现为Q1区颗粒减少。Q4区代表接合子数量。如图1所示，在特定浓度的不同金属下接合子增加，例如0.5 mmol/L铅（II）、0.1 mmol/L砷（V）和0.005 mmol/L汞（II），表明这些浓度的重金属促进了ARGs的转移。
图2. 暴露于不同浓度铜(II)、锌(II)、镉(II)、铅(II)、砷(V)和汞(II)的大肠杆菌MG1655与活性污泥细菌之间的接合频率。CK为无重金属胁迫的对照。
不同条件的转移频率通过公式（1）计算，如图2所示，这些重金属以浓度依赖方式影响转移频率。无重金属胁迫对照的转移频率定量为3.9×10^-2，接近RP4质粒向活性污泥细菌转移的频率（4.6×10^-3–7×10^-2）。在0.1–0.5 mmol/L铅（II）、0.001–0.005 mmol/L汞（II）和0–0.1 mmol/L砷（V）的金属胁迫下，转移频率与无重金属胁迫对照相比明显增加。而我们设定浓度梯度内的其他金属如铜（II）、锌（II）和镉（II）则抑制了ARG转移。根据转移频率，最促进ARG转移的重金属是0.005 mmol/L的汞（II）（7.39×10^-2），与对照相比转移频率增加了约两倍。0.5 mmol/L铅（II）（4.81×10^-2）和0.1 mmol/L砷（V）（5.27×10^-2）也分别使转移频率增加了1.25倍和1.35倍。
先前研究结果表明，大肠杆菌菌株与活性污泥之间的转移频率在约10^-7–10^-2之间变化。例如，携带pKJK5的大肠杆菌MG1655向活性污泥细菌的质粒转移为8.9×10^-3，大肠杆菌C600向污泥细菌的质粒RP4转移为8.8×10^-7–1.3×10^-2，比本研究中重金属条件下的频率低1–5个数量级。这意味着广泛存在的亚抑制水平重金属可能导致ARG转移的增加。
已有报道表明，抗生素耐药性的获得受水环境中多种物质的影响，如重金属。编码重金属抗性的基因可以与抗生素抗性基因位于同一遗传结构或同一细菌菌株内的不同遗传结构上。先前研究表明，海洋发光杆菌与大肠杆菌之间ARGs的水平转移可以被钒（III）、钙和汞以浓度依赖方式增强。大肠杆菌MG1655暴露于铜、锌和镉也导致接合率下降，与上述结果一致。
中国污水处理厂中重金属浓度据报道在1.9×10^-5–6×10^-3 mmol/L范围内。根据结果，较低浓度的重金属如0.001 mmol/L汞可以促进ARG转移，由于重金属在污水处理厂中广泛存在且在环境中化学稳定，亚抑制水平的重金属可能对ARGs的传播产生长期影响。
对于ARG转移的促进或抑制，已描述了金属胁迫的几种机制。大量证据表明，ROS产生在金属诱导毒性中发挥重要作用。重金属可导致氧化应激和SOS反应的诱导，增加细胞膜通透性，改变接合相关基因，即使在亚抑制浓度下，也可能促进接合转移。先前研究表明，有毒剂量的砷通过中间硫自由基化学导致ROS的产生。汞对[4Fe-4S]簇的直接或间接破坏可能导致额外的芬顿活性铁释放到细胞质中，导致ROS形成增加。ROS反应的出现和增加可能是ARG转移增加的原因。至于铅，它未能损伤细菌的纯化延胡索酸酶A，这与细胞活性相关。未受抑制的细胞活性导致转移率增加。
先前的硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定表明，铜和镉暴露通过脂质过氧化导致膜功能受损并导致细菌死亡。此外，镉、铜和锌可以破坏金属酶的铁硫簇，这在细菌代谢活动中发挥重要作用。此外，与铅相反，纯化的延胡索酸酶A可以被铜、镉和锌毒害。上述原因可能解释了铜（II）、镉（II）和锌（II）在我们设定浓度梯度内抑制ARG转移。
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