讨论
变形链球菌AtlA对正确的细胞分离、生物膜形成和自溶至关重要，也完全表达遗传能力所必需。先前工作中出现的一个显著发现是，AtlA在多种表面相关蛋白的生物发生中起关键作用。具体来说，缺乏AtlA的细胞的Zwittergent提取物与野生型菌株的提取物相比，蛋白质数量显著减少。此外，AtlA的缺失也影响主要粘附素P1的正确定位，后者通常通过分选酶共价连接到细胞壁。因此，AtlA是正常细胞表面生成的核心蛋白。
本文呈现的结果揭示，暴露于氧气对变形链球菌细胞表面生物发生以及已知毒力属性的表达或定位具有深远影响。变形链球菌形成生物膜的能力因氧气暴露而严重受损，这可能是由于外多糖代谢的改变或细胞-表面或细胞-细胞粘附的改变。这些发现暗示变形链球菌在早期生物膜与成熟生物膜中的体内行为可能非常不同。显然，AtlA和Vic通路对变形链球菌响应氧化环境至关重要。在本研究中，SMu0629，atlA操纵子的第一个基因产物，似乎具有作为氧化还原传感器的潜力，并调节AtlA的活性、成熟或定位，以及可能atlA操纵子编码的其他基因产物或其他自溶酶。此外，AtlA活性和atlA操纵子表达受VicRK TCS控制。据报道，VicK传感器激酶蛋白含有一个PAS结构域，该结构域是氧气和氧化还原电位的传感器。因此，利用Vic或AtlA调节通路破坏变形链球菌建立和持久性的策略可能在破坏致龋生物膜成熟方面具有前景。值得注意的是，尽管有一些与AtlA弱相似的蛋白质，但由于其独特特征、在允许变形链球菌正确阐述和定位毒力因子中的关键作用及其在生物膜成熟中的核心作用，该蛋白是抗龋治疗的有吸引力的靶点。
SMu0629可能作为硫醇-二硫键氧化还原酶发挥作用，因为预测的SMu0629蛋白含有高度保守的FX4CXXC基序，该基序是硫氧还蛋白超家族几个成员活性位点的典型特征。这些半胱氨酸残基通常以C-X-X-C基序排列，其中两个半胱氨酸残基在氧化二硫键和还原二硫醇形式之间可逆循环，从而参与氧化还原反应和电子流。使用蛋白质基序搜索工具，在变形链球菌UA159基因组中发现了总共10种蛋白质含有这种FX4CXXC基序，包括SMu0629。它们包括HopD（SMu0490）、NrdH（SMu0611）、CitX2（SMu0932）、ABC转运蛋白通透酶蛋白（SMu1094）、HemN（SMu1293）、TrxA（SMu1699）、TrxH（SMu1789）和保守的假设蛋白（SMu0860和SMu1044）。与胞质定位的硫醇-二硫键氧化还原酶（如硫氧还蛋白，具有低氧化还原电位并参与维持胞质的还原环境）不同，根据程序HMMTOP预测，变形链球菌SMu0629预计位于细胞质膜外。其他胞外硫醇-二硫键氧化还原酶包括最近发现的大肠杆菌DsbA蛋白，其催化跨膜运输蛋白质中二硫键的形成，以及大肠杆菌DsbC，其功能是重新分配靶蛋白半胱氨酸残基之间的二硫键。值得注意的是，SMu0629还包含八个保守的半胱氨酸，这些半胱氨酸可以氧化形成二硫键。有趣的是，atlA操纵子紧邻下游的一个基因（fer）编码一个铁氧还蛋白，该蛋白也包含一个C-X-X-C基序。铁氧还蛋白通常包含一个[4Fe-4S]簇，可以在多种代谢反应中转移电子。鉴于fer与atlA操纵子联系如此紧密，可能也与SMu0629存在功能联系。值得注意的是，SMu0629或Fer不太可能通过二硫键直接与AtlA结合，因为AtlA没有半胱氨酸。
SMu0629单独或与其他蛋白质协同，似乎调节AtlA水平。缺乏SMu0629导致可检测的AtlA蛋白显著减少，这反过来又转化为显著增强的自溶抗性。SMu0629对AtlA的影响可能不会在AtlA呈递到细胞表面后发生，因为用外源His标签AtlA蛋白处理629NP或629P菌株和SAB95导致正常链长的完全恢复和AtlA的正常成熟。这些发现表明，SMu0629可能直接或间接参与在AtlA靶向细胞表面之前控制AtlA活性或成熟，并且这种效应依赖于氧化还原环境或足够氧气水平的存在。值得注意的是，SMu0629蛋白似乎不是H2O2形式的氧化应激耐受性所必需的，但缺乏SMu0629的菌株生长减弱和突变体生物膜形成能力受空气改变暗示该蛋白的活性对于允许细胞应对氧化环境中的生长至关重要。我们目前正在确定这些观察结果的潜在基础。
本研究的另一个重要发现是变形链球菌VicRK TCS与自溶之间存在联系。这一发现主要得到以下观察结果的支持：VicK缺陷型变形链球菌菌株的表型在很大程度上是由于AtlA加工不当所致。atlA操纵子的表达受Vic系统影响，尽管尚不清楚vicK背景下的转录减少是否是VicR激活缺失的直接结果。VicK的缺失导致细胞链长和形态的改变，类似于先前报道的AtlA缺陷突变体。引人注目的是，在vicK突变体中，AtlA加工为其成熟79 kDa形式几乎完全被抑制，导致的自溶抗性水平实际上远高于atlA缺陷突变体观察到的水平。此外，vicK缺陷突变体对氧气暴露的反应在细胞形态和形成生物膜能力方面与atlA缺陷菌株非常相似。vic基因无论氧气存在与否都持续表达，而SMu0629基因和atlA响应好氧条件差异表达。因此，Vic系统可能不仅参与调节响应氧气浓度加工AtlA所需的基因产物，而且可能参与其他自溶酶网络或以增强自溶抗性的方式修饰包膜的基因。SMu0629和其他氧化还原感应蛋白可能通过修饰加工AtlA所需的基因产物的活性施加其影响。
在我们目前的工作中，vicK突变体4% SDS提取物中两种蛋白质的数量特别显著增加。一种被鉴定为细胞壁蛋白前体（SMu0555），与戈登链球菌推定的N-乙酰胞壁酰胺酶/溶素和肺炎链球菌胆碱结合蛋白D具有同源性。与vicK缺失细胞相关的另一种蛋白质是糖基转移酶-SI酶（GtfC），其在形成变形链球菌顽固生物膜的粘附支架水不溶性葡聚糖中起重要作用。我们的初步结果表明，在这些条件下gtfC的转录没有显著改变。此外，我们的SDS-PAGE和Western印迹分析显示，GtfB和GtfC在vicK突变体的全细胞裂解物中均升高，表明对Gtf定位的转录后影响。我们提出，VicK的缺失导致细胞表面的显著重塑，可能是其影响AtlA成熟的直接结果。反过来，已知在缺乏AtlA的菌株中发生的包膜变化允许像GtfC这样的酶优先与细胞相关。这一发现可能对早期生物膜形成以及口腔中生物膜成熟和持久性具有特殊意义，因为暴露于较高空气水平的生物体的细胞表面可能比更厌氧环境中的细胞具有不同的粘附和外多糖形成潜力。因此，Vic和AtlA可能在响应氧化还原环境立法细胞表面组成中起核心作用。
已知VicKR TCS在肺炎球菌毒力中起关键作用。细胞壁合成缺陷、生物膜形成和能力发育缺陷，以及对抗生素的敏感性和毒力减弱，都与Vic系统的缺失有关。两个基因，pspA（表面毒力因子）和pcsB（胞壁质生物合成基因），已知在肺炎链球菌中受VicRK控制。变形链球菌的PcsB同源物作为葡聚糖结合蛋白发挥作用，并负责正常的细胞壁合成。有趣的是，注释为SMu0555和SMu0760基因的蛋白质编码的蛋白质包含在AtlA中也发现的I-III-I-II基序，与PcsB旁系同源。因此，Vic可能具有广泛调节裂解通路和管理细胞表面组成和结构的潜力。
我们的结果解决了关于AtlA调节的几个关键问题，并进一步支持了该通路与变形链球菌其他毒力属性表达之间的相互联系，包括生物膜形成和外多糖生产。也许最重要的是，我们揭示了氧气是强烈影响细胞包膜组成和生物膜发展的关键环境因素。我们的结果提供了直接证据，表明VicRK TCS和AtlA通路，包括SMu0629，位于该生物体响应大气成分以控制基因调节和细胞表面组成和结构的中心，这将强烈影响在人类宿主中的建立、持久性和毒力表达。正在进行研究以进一步剖析AtlA的调节和加工，并评估AtlA作为破坏变形链球菌致病性靶点的潜在效用。
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