摘要
目的 明确农杆菌介导的黄粱木遗传转化体系对筛选物的敏感浓度，为黄粱木遗传转化研究奠定基础。方法 以黄梁木子叶、胚轴和无菌苗为材料，探讨筛选物卡那霉素、潮霉素、头孢霉素对试验材料生长的影响，以及对农杆菌LBA4404的抑菌效果。结果 在不定芽分化、生根阶段，卡那霉素的临界浓度分别为20、10 mg/L，潮霉素的临界浓度均为10 mg/L；当头孢霉素的浓度为100 mg/L时，完全抑制农杆菌生长，而且该浓度对黄梁木不定芽分化、生根影响较小。结论 在黄梁木子叶和胚轴为试验材料的遗传转化体系中，20和10 mg/L的卡那霉素可作为不定芽分化、生根阶段的筛选选择压，10 mg/L的潮霉素可作为两个阶段的筛选选择压；而100~200 mg/L的头孢霉素可作为农杆菌LBA4404的抑菌浓度。
1 材料和方法
1.1 试验材料、农杆菌株和试剂
饱满成熟的黄梁木种子，来源于广西药用植物园本草纲目园区内一株20 a树龄的健康植株。
在超净台上将种子灭菌，转移到无激素的MS固体培养基上培养，25 d后，切取无菌植株的子叶和胚轴作为不定芽分化诱导材料；生根诱导材料则将无菌植株茎的下部分切除，先转接到增殖培养基上培养20 d，再进行生根诱导试验。
卡那霉素(kanamycin，简写Km)、潮霉素(hygromycin，简写Hm)、头孢霉素(cefotaxime，简写Cef)，以及所使用的DCR培养基、MS培养基、蔗糖、琼脂和激素等均购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，含植物表达载体pBI121-GUS的农杆菌LBA4404为本实验室保存。
1.2 培养基
按前期再生体系优化得到的培养基。分化培养基DCR+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；增殖培养基 MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L；生根培养基：1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。
所有培养基均添加蔗糖30.0 g/L，琼脂5.6 g/L，pH值均调至5.8~6.0，高温高压灭菌后，冷却到55℃左右，按不同试验目的加入相应的筛选物，摇匀、分装，凝固1 d后待用。
1.3 筛选物对外植体分化和生根影响的浓度梯度设置方法
参考其他木本植物对筛选物敏感情况和预试验，同一种筛选物在不定芽分化和生根诱导这两个试验阶段，设置的浓度梯度相同，即卡那霉素的浓度梯度为0、4、6、8、10、15、20和50 mg/L；潮霉素的浓度梯度为0、2、4、6、8、10和12 mg/L，而头孢霉素的梯度设置为0、25、50、100、150、200、300和400 mg/L。每个浓度均设置3次重复。
1.4 筛选物头孢霉素对农杆菌抑制效果的处理方法
为了便于校正和检验抑菌试验可能存在的误差，共设计农杆菌直接浸染外植体和Bioscreen全自动生长曲线分析仪监测法进行农杆菌抑制试验。前者直接观察菌斑的生长状况，统计农杆菌出现的时间(d)，后者通过仪器自动测量培养液的光密度(OD600)值，实时监测菌株的生长情况。头孢霉素浓度梯度设置为0、25、50、100、150、200、300和400 mg/L。每个浓度均设置3次重复。
1.4.1 直接浸染外植体法
① 在含有卡那霉素、利福平的YEB液体培养基中，培养农杆菌LBA4404至OD600值为0.8；
② 将在分化培养基培养30 d的愈伤组织，切长、宽和高均约为0.3 mm小块，用步骤1培养好的YEB菌液浸染5 min；将愈伤组织表面菌液吸干，转入含头孢霉素浓度梯度的分化培养基中培养。
1.4.2 Bioscreen全自动生长曲线分析仪监测法
① 在100孔微孔板中，每孔加入200 μL含不同浓度头孢霉素(浓度梯度同上)的YEB液体培养基。每个浓度设置3个重复孔，并设置不含头孢霉素的对照孔和不接菌的空白对照孔。
② 将活化至OD600值为0.8的农杆菌LBA4404菌液，以1%的接种量接种至各孔中(空白对照孔加入等体积无菌YEB培养基)。将微孔板置于Bioscreen C全自动生长曲线分析仪中，设置培养条件为28℃，采用连续振荡模式(中速)，仪器自动每隔1小时测定一次OD600值，持续监测48小时。实验结束后，导出各孔的生长曲线数据进行分析。
1.5 测定指标
外植体的分化率、平均长芽个数、白化率、生根率、死亡率和农杆菌斑生长情况。
分化率=诱导出不定芽的外植体个数/外植体总个数×100%；平均长芽个数=不定芽总个数/外植体总个数×100%；白化率=白化的外植体个数/外植体总个数×100%；生根率=诱导出根的外植体个数/外植体总个数×100%；死亡率=外植体死亡个数/外植体总个数×100%。
1.6 数据分析和作图
采用SPSS Ver19.0、Excel 2016进行。试验采用3次重复，结果为3次试验数据的平均值±标准差，并通过Duncan's multiple range test方法进行分析显著性差异(P<0.05)。
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