PL处理对30°C孵育期间枯草芽孢杆菌孢子热敏感性的影响
枯草芽孢杆菌孢子经过PL处理后，细胞悬浮液在30°C孵育。在不同时间（由图1中的虚线表示），枯草芽孢杆菌细胞接受热处理（90°C，10分钟），该处理灭活发芽的但不灭活休眠的孢子。在时间0，热处理引起未处理孢子和暴露于最弱PL处理（0.3 J/cm²）的孢子的可培养性轻微丧失（图4）。相比之下，当孢子先前暴露于更高的总能量密度（>0.3 J/cm²）时，发现孢子热抗性显著降低，这可能表明PL会使细菌孢子对后续热处理敏感。
由于孢子计数减少高于单独应用两种处理所达到的灭活水平之和（加性效应），可培养性的增加丧失将归因于PL和热处理的协同效应。例如，单独暴露于1 J/cm²能量密度或90°C热处理10分钟分别使枯草芽孢杆菌孢子计数减少2.3和0.5 Log。然而，当枯草芽孢杆菌孢子先接受PL处理再加热时，获得了超过4 Log的细胞计数减少。此外，PL预处理的孢子比具有相同总和可培养细胞密度的混合群体（死细胞和活细胞的混合物）表现出更高的热敏感性（图4），这证实了两种处理之间的协同效应。根据本研究结果，先前研究已证明细菌孢子在先前超声处理、辐照、臭氧化、加压或UV处理后热抗性降低。
图4 显示枯草芽孢杆菌（B. subtilis）细胞在30°C TSB培养基中孵育时的热敏感性。空心圆点表示未处理孢子，实心圆点表示经0.3 J/cm²光热处理（PL）的孢子；向上指实心三角形表示经1 J/cm² PL处理的孢子，向上指空心三角形表示总细胞密度为10⁶个/mL的孢子；向上指实心方块表示经2 J/cm² PL处理的孢子，向上指空心方块表示总细胞密度为10⁴个/mL的孢子；向上指实心菱形表示经5.5 J/cm² PL处理的孢子，向上指空心菱形表示总细胞密度为10²个/mL的孢子；星号表示经12 J/cm² PL处理的孢子。误差线表示95%置信区间，连续线表示检测限。图1中不连续线表示30°C TSB培养基孵育过程中施加热处理（90°C，10分钟）的时间点。
枯草芽孢杆菌细胞在30°C孵育的前3小时内逐渐失去热抗性（图4）。由于已知孢子比其营养体对应物对热处理具有相当大的抗性，这些结果表明孢子群体在此时期转变为营养细胞。枯草芽孢杆菌细胞的热敏感性从3至24小时没有显著增加，因此孢子发芽后，枯草芽孢杆菌细胞在指数生长期（6小时）和稳定生长期（24小时）对热处理同样敏感。尽管这种热抗性的增加丧失在先前暴露于1至2 J/cm²能量密度的枯草芽孢杆菌细胞孵育期间也很明显，但由于达到检测限，无法在孵育3小时后评估抗性。由于检测限，也无法确定更高总能量密度（5.5 J/cm²）对枯草芽孢杆菌后续热处理敏感性的影响。
PL处理后热敏感性增加可归因于几个原因。如前所示，存活PL的孢子可能具有亚致死损伤，这使它们对后续热处理更加敏感。PL技术的抗菌作用主要归因于DNA损伤和其他结构修饰，如枯草芽孢杆菌孢子变形或解体。PL和热处理的互补作用模式针对不同的细胞功能，这也可能是亚致死PL处理后枯草芽孢杆菌孢子热敏感性增强的原因。
另一方面，后续热处理可能抑制或降低修复先前PL处理造成损伤的能力（例如，DNA修复机制），增加这种处理序列的抗菌效果。尽管需要进一步研究阐明热和PL协同作用的机制，但这种联合工艺作为细菌孢子灭活的有前景的保存方法出现。
PL处理对枯草芽孢杆菌细胞发芽和营养生长不同阶段的影响
PL处理应用于在TSB（30°C）中孵育不同时间的枯草芽孢杆菌细胞，以确定枯草芽孢杆菌最易感的生理状态。如图5所示，枯草芽孢杆菌细胞的敏感性在从孢子到营养细胞的转变及随后的营养生长期间发生变化。除测试的最低能量密度（0.5 J/cm²）外，在发芽早期阶段（孵育1小时）发现枯草芽孢杆菌细胞对PL的抵抗力暂时增加。当时，发芽群体比休眠孢子更具抗性。类似地，先前已描述枯草芽孢杆菌在发芽完成前对UV辐照的短暂高抗性期。从明相（折光性）到暗相孢子的转变，与DPA的释放和孢子的再水化相关的现象，导致OD₆₀₀下降，这可能使细胞群体对入射光的暴露更高，因此枯草芽孢杆菌细胞计数的减少应该更高。因此，这种高PL抗性阶段将归因于枯草芽孢杆菌细胞的结构或生理修饰，而不是微生物对光的更高暴露。
图5 PL处理对30°C萌发过程中不同时间间隔下枯草芽孢杆菌（B. subtilis）可培养性的影响。误差线表示95%置信区间。
如先前在UV处理中描述的，这种高PL抗性阶段可能与DNA中孢子光产物和嘧啶二聚体形成的低效率或发芽切除修复的诱导在其他阶段不表达有关。在这种PL抗性增加之后，枯草芽孢杆菌细胞从孵育1至3小时变得更加敏感（图5）。细菌孢子完全转变为营养细胞可能是这种对PL处理敏感性增强的原因，如先前对热处理所述。相应地，一些先前研究表明，孢子对PL处理的抵抗力将比营养群体高得多。然而，枯草芽孢杆菌细胞的PL敏感性在3小时后没有显著增加（图5），在指数生长期（6小时）和稳定生长期（24小时）同样敏感。尽管需要进一步研究确定这一现象的原因，但在优化PL处理时应考虑枯草芽孢杆菌细胞在孢子发芽及随后生长过程中对PL敏感性的变化。考虑到枯草芽孢杆菌营养细胞比孢子对PL的抵抗力低，这种处理可以与刺激孢子发芽的条件结合，以增加其去污效果。
结论
尽管一些先前研究已报道PL技术对孢子灭活的影响，但据我们所知，这是第一项描述PL处理对发芽动力学及随后营养生长影响的研究。只有高强度处理完全阻止了枯草芽孢杆菌孢子发芽及随后生长。较低的总能量密度（0.3–5.5 J/cm²）对发芽几乎没有影响或没有影响，但延迟了营养生长，这可以延长液体食品或表面去污固体食品的保质期。诱导生长延迟（更长滞后期）的PL处理降低了枯草芽孢杆菌内生孢子的热抗性，指出了这种联合处理的潜在应用。
如果这一结论扩展到其他复杂基质和微生物，这种联合工艺可以实施以有效去污光线穿透有限的复杂产品。与热处理一样，枯草芽孢杆菌细胞对PL的敏感性在孢子发芽及随后营养生长过程中发生变化。一旦孢子发芽，无论是对热处理还是PL处理，指数生长期或稳定生长期的细胞的抵抗力相似。尽管需要进一步研究调查PL预处理诱导的后续热敏感性增强的持久性，但本研究结果表明PL技术作为传统方法的有前景的替代方案的潜力，以减少枯草芽孢杆菌在水和营养丰富培养基中发展的可能性。
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