摘要
研究没食子酸对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑菌活性和机理。通过测定没食子酸对溶藻弧菌的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和生长曲线，研究没食子酸对溶藻弧菌的抑菌活性；测定不同浓度的没食子酸溶液与溶藻弧菌作用前后，菌液上清液中碱性磷酸酶(AKP)活性、电导率，溶藻弧菌生物被膜、运动性和聚集能力的变化，研究没食子酸对溶藻弧菌的抗菌机理。结果显示，没食子酸对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为4 mg/mL和8 mg/mL。没食子酸能破坏溶藻弧菌的细胞壁，增加其细胞膜通透性，抑制生物被膜的形成，清除成熟的生物被膜，抑制溶藻弧菌的运动和聚集能力。本研究为探明没食子酸抑制溶藻弧菌的作用机理奠定了良好的基础，为其防治水生动物溶藻弧菌感染性疾病提供了理论依据。
正文
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)的无芽孢、无荚膜的嗜盐、嗜温厌氧性革兰氏阴性细菌，广泛分布于海水、入海口和水产养殖环境中，对多种水产动物和人有致病性。近几年，溶藻弧菌是引起水产动物育苗期和养成期死亡的主要病原之一，溶藻弧菌感染鱼类可导致出血、溃疡或败血症，感染虾类可致虾苗细菌性玻化症(bacterial vitrified syndrome,BVS)或对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease)、黑鳃烂鳃或白便综合征，感染螃蟹(Portunus tritubercularus)可致“牛奶病”或牙膏病，感染海参(Apostichopus japonicus)可致腐皮综合征(skin ulcerative syndrome,SUS)。此外，溶藻弧菌感染还能引起贝类发病，给海水养殖业造成巨大的经济损失。因此，开发绿色高效的抗弧菌病药物已成为当前海水养殖动物疾病防治研究的热点之一。
本课题组曾以分离自患有细菌性玻化症虾苗的溶藻弧菌和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为研究对象，开展了50味中药的抗菌活性研究，结果显示，诃子(Chebulae fructus)、五倍子(Galla chinensis)、第3期王春元等:没食子酸对溶藻弧菌的抑菌活性及机理研究213石榴皮(Granati pericarpium)、地榆(Sanguisorbae radix)等中药的抑菌效果相对较好，以诃子为主药的处方[诃子30 g、五味子(Schisandra chinensis)20 g、香附(Cyperi rhizome)20 g]对溶藻弧菌人工感染虾苗致细菌性玻化症的治疗效果也较好。鞣质是诃子、五倍子、石榴皮和地榆(刘海英,2009)等中药中非常重要的多酚类活性成分，它是由没食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其他多元醇)酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及二者混合共同组成。已有报道证明，没食子酸(gallic acid,GA)具有较好的抗菌、抗炎、抗氧化、保护肝脏和提高免疫功能等多种药理作用，其可能成为一种潜在的防病保健兽药或饲料添加剂使用。
中药可通过抑制细菌生物膜的形成和发育、破坏细菌的细胞壁和细胞膜、影响菌体蛋白质和遗传物质核酸的合成、促进氧化应激的产生以及抑制毒力因子的表达等方面的作用来抑制或杀灭细菌。虽然没食子酸已被报道对多种细菌有良好的抗菌作用，但尚未报道其对溶藻弧菌的抗菌活性和可能的作用方式。本研究探讨没食子酸对溶藻弧菌的抗菌活性及其作用机制，为筛选和研发防治水产动物弧菌感染性疾病的药物提供数据支持。
1、材料与方法
1.1实验菌液的制备
溶藻弧菌：菌株实验室编号为P4A，分离自患BVS对虾养殖场的凡纳对虾(Penaeus vannamei)虾苗，保存于中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖病原库。将冻存的溶藻弧菌复苏后，以TSB固体培养基活化纯培养，挑取单菌落接种于TSB培养基，于28℃、180 r/min恒温振荡过夜培养至对数生长期。
1.2药液的制备
没食子酸：纯度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。以PBS将没食子酸配制成16 mg/mL的药液，过滤除菌，并用PBS倍比稀释制成不同浓度的没食子酸溶液，4℃保存备用。
1.3最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
采用二倍稀释法测定。取对数生长期的溶藻弧菌，用TSB培养基稀释至1×10⁶CFU/mL。分别取100μL不同浓度的没食子酸溶液加入96孔板，并加入等量的1×10⁶CFU/mL菌液，再以菌液加等量PBS为阳性对照组，TSB培养基加等量PBS为空白对照组。实验组和对照组分别加入氯化三苯四氮唑(TTC)10μL，以检验细菌是否生长。每组设3个平行。将96孔板置于28℃恒温培养箱中培养，当阳性对照组变红时，记录没食子酸的抑菌效果，实验组变色孔的上一个孔所对应的浓度即为MIC。从未变红的实验组各孔取样100μL，分别涂布于TSB琼脂平板，28℃恒温培养箱培养24 h，观察结果。琼脂平板上细菌菌落数少于5且药液浓度最低的，即为MBC。
1.4生长曲线测定
测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生长的影响。按1.3中的方法配制菌液。取1×10⁶CFU/mL溶藻弧菌菌液100μL，分别加入不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC和1/4MIC。以菌液加等量PBS为阳性对照组，TSB加等量PBS为空白对照组，每组设3个平行。在全自动微生物生长曲线测定仪中28℃培养24 h，每隔2 h在600 nm波长下测定各组吸光值。