2.4 电还原奶中双歧杆菌在冷藏储存期间的存活
基于第2.2和2.3节所述试验结果，仅对三种菌株进行冷藏储存期间的细胞存活研究：两歧双歧杆菌KYO、长双歧杆菌ATCC 15708和动物双歧杆菌乳亚种DSM 10140。将1 mL解冻的储备培养物添加到99 mL MRS培养基中，随后在厌氧条件下于37°C培养（两歧双歧杆菌KYO和长双歧杆菌ATCC 15708培养16小时，动物双歧杆菌乳亚种DSM 10140培养24小时）。新鲜培养物离心（8000 × g，20分钟，4°C）并重悬于10 mL巴氏杀菌脱脂乳中。该悬液用于接种。
进行了四种处理，每种五个独立重复。每种处理的样品使用微滤巴氏杀菌脱脂乳制备。处理应用如下：
电还原巴氏杀菌奶的制备：将250 mL牛奶转移至经高压灭菌（121°C，10分钟）灭菌的H型膜电解池（图1）中。通过在不锈钢阴极和Ag/AgCl参比电极之间施加-1.55 V电压对样品进行电还原。使用磁力搅拌器搅拌牛奶以尽量减少阳离子膜（Neosepta CMX-SB）上的污垢。处理40分钟以达到低于-300 mV的负氧化还原电位值以及2至3 mg/L的溶解氧浓度。阳极侧使用的电解液为0.1 M硫酸溶液。处理期间监测氧化还原电位（mV）和溶解氧（mg/L）。处理后，将处理过的牛奶连同电解池立即转移至厌氧室，转移至灭菌500 mL玻璃瓶中，在冰水浴中冷却至7°C后接种。
图1：电解池简化示意图
脱气巴氏杀菌奶的制备：将500 mL牛奶转移至无菌真空2 L锥形瓶中，施加真空30分钟并用搅拌棒搅拌。脱气后，在氮气流下立即将牛奶转移至两个无菌250 mL玻璃瓶中，并转移至厌氧室以尽量减少氧的重新进入，冷却至7°C后接种。
半胱氨酸补充奶的制备：将250 mL脱气奶冷却至7°C，添加2.5 mL（10%）半胱氨酸-HCl溶液。该半胱氨酸溶液用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）配制，以尽量减少添加时对牛奶pH的影响。
本研究使用了三种不同类型的对照样品。（i）第一种为接种的巴氏杀菌奶，未进行进一步处理。该奶与其他处理奶保存在相同类型的小瓶中；作为双歧杆菌生长/存活的比较手段。（ii）第二种对照为接种的巴氏杀菌奶，储存在带泡沫盖的大瓶中，允许牛奶与环境之间的气体交换。（iii）第三种对照为未接种奶的小瓶，用于跟踪储存期间嗜冷菌的演变以及物理性质的变化。
接种以使初始计数达到约10⁷ cfu/mL。为防止取样过程中氧和氧化还原的变化，实验不是通过从单个烧瓶在不同培养时间取样进行的。相反，接种后将牛奶分装至使用特氟龙盖封闭的20 mL气相色谱小瓶中（每样品一小瓶）。除对照（ii）外，瓶子完全装满牛奶样品，并注意尽量减少顶空。所有样品在7°C培养4周。脱气或电还原奶样品储存在厌氧罐中以确保氧不能重新进入牛奶。在每个给定的培养时间，打开所需数量的小瓶进行分析。进行了五次独立重复。
2.5 分析
通过在MRS-半胱氨酸琼脂（添加0.5 g/L半胱氨酸-HCl的MRS）上涂布（0.1 mL）适当的蛋白胨水稀释液获得双歧杆菌活菌计数，并在厌氧室中于37°C培养48小时。嗜冷菌计数（来自对照瓶）在3M Petrifilm好氧菌计数板上于7°C培养10天后进行。氧化还原水平使用连接Oakton pH计的铂电极测定，使用250 mV氧化还原缓冲液校准。溶解氧使用装有指定膜并充满所供DO电解液的VWR Symphony电极测量。电极连接VWR Symphony SP50D便携式DO仪。电极每2小时按供应商手册所述校准。pH使用连接Oakton pH计的Oakton电极测定，使用pH 4和pH 7缓冲液校准。电极用70%乙醇溶液灭菌。
对于基于氧敏感性的菌株筛选，需氧和厌氧条件下每种双歧杆菌菌株的初始和最终活菌计数差异（delta）使用SAS软件进行T检验。细胞生长研究的方差分析根据分割区组模型进行，油效应在全区组，培养基效应在分割区组单元，使用SAS软件。第2.4节的菌体数据和测量参数使用同一软件的混合程序结合Bonferroni P值调整进行分析。
3. 结果与讨论
3.1 脱气奶中的筛选试验
表1展示了脱气对八种不同双歧杆菌菌株在巴氏杀菌奶中冷藏储存2周期间存活的影响结果。尽管接种水平接近10⁷ cfu/mL，但各试验之间存在一些小的变化，数据以最终和初始群体之间的差异（delta）进行分析。这些结果清楚地表明，氧敏感性因菌株而异，这与其他研究一致，并证实了筛选步骤的有用性。在本研究中，两歧双歧杆菌KYO（P = 0.9232）对牛奶中氧的存在最耐受，而婴儿双歧杆菌ATCC 15697（P = 0.0098）最不耐受。五种菌株在+7°C的牛奶中在厌氧和需氧条件下均显示轻微活菌数增加。一些双歧杆菌在+4°C时具有相同的表观生长能力。在储存2周期间显示活菌数增加的菌株中，通常在无氧条件下观察到更好的生长。同样，在无氧条件下观察到较低的死亡率，动物双歧杆菌乳亚种DSM 10140除外。尽管双歧杆菌被归类为厌氧菌，但已证明一些菌株具有克服氧毒性有害影响的酶机制。通过T检验的统计分析表明，仅短双歧杆菌ATCC 15700、婴儿双歧杆菌ATCC 15697和长双歧杆菌ATCC 15708菌株在需氧和厌氧条件下的存活存在显著差异（P分别为0.0279、0.0098和0.0387）。所有样品在实验开始时以及2周冷藏储存后在两种条件下均未检出嗜冷微生物（结果未显示）。
表1：非发酵奶中冷藏储存2周后双歧杆菌的存活率和最终测量参数
| Strain | Non-deaerated milk | Deaerated milk | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Delta (log10 cfu mL—1) | pHa | Redoxb (mV) | DOc (ppm) | Delta (log10 cfu mL—1) | pHa | Redoxb (mV) | DOc (ppm) | ||
| B. bifidum KYO | 0.53 | 6.50 | +255.03 | 5.23 | 0.58 | 5.96 | —428.00 | 0.30 | |
| B. longum Rosell-R023 | 0.22 | 6.52 | +255.07 | 5.23 | 0.56 | 5.94 | —450.67 | 0.43 | |
| B. longum 411 BBL | 0.11 | 6.52 | +253.03 | 6.10 | 0.09 | 6.43 | —459.53 | 0.37 | |
| B. breve ATCC 15700d | 0.53 | 5.94 | +241.83 | 4.13 | 1.66 | 5.31 | —422.67 | 0.70 | |
| B. bifidum ATCC 29521 | 1.80 | 6.41 | +258.07 | 5.20 | 1.98 | 5.98 | —440.13 | 0.53 | |
| B. infantis ATCC 15697d | —2.86 | 6.68 | +251.77 | 6.27 | —0.16 | 6.56 | —466.00 | 0.23 | |
| B. longum ATCC 15708d | —2.54 | 6.58 | +254.37 | 6.50 | —0.60 | 6.52 | —486.00 | 0.20 | |
| B. animalis subsp. lactis DSM 10140 | —0.18 | 6.62 | +247.07 | 6.30 | —0.54 | 6.58 | —458.00 | 0.13 |
细胞生长与pH降低相关（表1）。事实上，回归分析显示脱气样品的最终pH与delta log值之间存在一定关系（R² = 0.70）。这 presumably 是由于乳糖发酵形成乙酸和乳酸。达到的最低pH值为5.31，由短双歧杆菌ATCC 15700在厌氧条件下产生（表1）。双歧杆菌菌株在酸性环境中的生长和存活方面存在差异。尽管本研究中观察到的pH值不如酸奶低，但酸化并未影响细胞增殖和存活，因为在脱气和未脱气奶中至少在pH 5.3和5.9时出现了正值delta。
牛奶脱气使牛奶氧化还原电位的初始值降至零以下（-70 mV）（表1）。在氧存在下，冷藏2周后牛奶的氧化还原电位值保持正值，在+241.83至+258.01 mV范围内，高于牛奶的初始氧化还原电位值（表1）。另一方面，厌氧培养的牛奶中氧化还原电位降至负值。氧与氧化还原电位之间的关系仍然难以解释。然而，有建议认为它们之间的关系取决于培养基的化学成分，该成分因微生物的代谢活动而逐渐变化。这一现象表明双歧杆菌在每种条件（需氧和厌氧）中暴露于不同的培养基特性。
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