为了确保食品的微生物质量和安全,人们对使用预测模型来量化和预测微生物行为产生了兴趣。不同的环境因素和防腐剂对丝状真菌的生长前的滞后期和生长速度的影响是不同的。由于丝状真菌的生长习性,在丝状真菌特别是产真菌毒素的菌种上进行此类实验较为困难,本论文的研究的目的就是开发一种自动比浊仪度法(Bioscreen)快速筛选抗真菌化合物以及其对黄曲霉的初始生长动态的影响,并利用提出的方法与LPM相联系用于最低抑制浓度MIC和非抑制浓度(NIC)值的准确定量来评价抗真菌化合物在不同环境下对黄曲霉的抑菌作用条件。


全自动生长曲线分析仪的应用


应用全自动生长曲线分析仪Bioscreen测试了丝状真菌黄曲霉素中加入不同浓度的丙基丙烷硫代磺酸盐(PTS)后对应的生长曲线图(OD600),对比了丝状真菌在不同不同环境下的生长情况,并计算了它们在不同条件下的对应的O600值上的差异。测试的生长曲线的周期为7天,每隔20分钟测试一次OD600值,培养过程中各菌株的摇晃、生长及OD值的测试全是自动完成的,从而筛选获得抗真菌化合物PTS对丝状真菌黄曲霉素的最低抑制浓度MIC和非抑制浓度(NIC)值。


实验结果


开发了一种全自动的比浊度法(Bioscreen C)检测丝状真菌黄曲霉在不同环境条件下的初始生长动态,此种方法可快速筛选抗真菌化合物,并对其进行生态生理学研究,并利用所提出的方法与LPM相联系用于最低抑制浓度MIC和非抑制浓度(NIC)的计算,可准确定量评价抗真菌化合物在不同环境下对黄曲霉的抑菌作用效果。研究表明建立的这种比浊度方法对于抗真菌化合物的快速筛选生长和丝状生物次生代谢产物的产生的研究具有如缩短时间,所需培养基体积小等重要的优势来比较相关不同抗真菌化合物的疗效。

图1、在含有(A)0.2%和(B)0.125%w/v琼脂的YES培养基中,接种了105/ml的A.flavus孢子(25 C),获得其对应的生长曲线图。

图2、含0.125%琼脂w/v(25 C)的YES培养基中,初始浓度为102-106/ml的孢子的黄曲霉接种后获得的平均生长曲线图(10条微生物的个体生长曲线的平均值)

图3、在Bioscreen C分析仪的100孔的微孔板加载不同体积的菌种后得到的平均生长曲线(10条个体曲线平均值)。接种量为金黄色葡萄球菌105/ml,培养温度为25℃。

图4、通过两次不同接种量的黄曲霉与外源黄曲霉在不同培养时间下的平均生物量比较。培养温度为20℃。

图5、不同条件下获得的丝状真菌的生长曲线图(5条个体曲线),显示获得的生长曲线是在不同温度下,7天后在含有0.125%琼脂w/v的YES培养基内接种具有代表性浓度的PTS,接种浓度为105/ml的黄曲霉孢子。(A)25 C和0.995aw;(B)25 C和0.95aw;(C)20c和0.995aw;(D)20 c和0.995aw。


总结


本论文主要开发了一种快速筛选抗真菌化合物,并进行生态生理学研究的高通量方法,利用特殊的半固态培养基对丝状真菌进行了研究,采用分光光度/浊度法测量,所使用的仪器设备是Bioscreen C全自动生长曲线分析仪,该仪器结合2块100孔的微孔板可同时平行测试多个各种菌株样品的生长曲线,并且所有的过程都是自动化的。本论文的研究人员全面研究了培养基的组成和制备,接种剂的大小,培养基体积和孵育参数等用于测量初始真菌的萌发和生长动态的优化,全自动生长曲线分析仪Bioscreen C在本研究工作中主要是用于评估18种浓度的丙基丙烷硫代磺酸盐(PTS)在不同的环境下对黄曲霉的抑制作用。研究过程采用了一种以前用于细菌抑制的数学模型方法,即超过7天的自动化周期培养,每20分钟测量一次,很好的获得相关的最低抑制浓度(MIC),并计算了非抑制浓度(NIC)值。从以上研究可以看出应用全自动生长曲线分析仪Bioscreen分析仪建立的这种筛选抗真菌类的方法对于快速筛选生长和丝状生物次生代谢产物的产生和利用具有非常好的应用前景,尤其是该设备能够缩短测试时间,研究所需培养基体积量少,这也说明全自动生长曲线分析仪Bioscreen不仅可用于研究腐败菌和致病菌,还可用于丝状真菌病原体的生态生理学和抗真菌筛选,为相关微生物领域的研究人员在筛选各类微生物提供了重要的技术支持。


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