线粒体组分分离和呼吸能力评估。 对新鲜分离的线粒体进行氧化磷酸化能力测量和蓝绿原生胶测定，按已发表的方法进行 (52-54)，修改为在 8P 平板 (55) 上培养动物，并使用尼龙编织网筛 30、40 和 110 微米来清洁和根据大小分选线虫。
酵母测定。 酿酒酵母单倍体品系均衍生自同基因的 BY4741 MATa 或 BY4742 MATa 背景。缺乏 rip1 的酵母（品系 BW998）从酵母缺失集合中获得，并通过 PCR 确认缺失的存在（Open Biosystems）。固体培养基是 CSM-URA 补充 2%（重量/体积）葡萄糖，通过使每个样品的吸光度相等来标准化细胞数量。将细胞在水中进行五倍系列稀释，并将每种稀释液 4μL 点样到指定的含有 2%（重量/体积）琼脂的固体培养基上。对于液体生长实验，在 CSM-URA 2%（重量/体积）葡萄糖液体培养基中培养过夜培养物，并使用这些过夜培养物的 5μL 接种 145μL 新鲜培养基，该培养基由 1%（重量/体积）酵母提取物、2%（重量/体积）蛋白胨和 2%（重量/体积）葡萄糖组成。使用 Bioscreen C MBR 生长曲线分析仪测定生长速率，如所述 。
结果
分离抑制秀丽隐杆线虫isp-1(qm150)发育迟缓的突变
图1. isp-1(qm150)的基因内抑制因子可改善发育迟缓现象，且均位于束缚区域。(A) 在25°C下同步化L1阶段释放48小时后，N2、isp-1(qm150)及其中一种抑制因子的发育情况。(B) 通过复杂对象参数分析分选仪(COPAS)评估在25°C培养48小时（N2）或60小时（isp-1(qm150)及抑制因子株系）的群体个体大小（每株系n=6,000）。N2在48小时检测以防止子代大量污染。(C) isp-1基因结构图，绿色标注抑制突变的位置、残基及发生率，红色标注isp-1(qm150)的P>S突变。(D) 采用ClustalW比对并通过Boxshade呈现酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、原鸡和智人的ISP蛋白序列。各片段左侧数字表示首个所示残基的氨基酸编号。功能相同的图1. isp-1(qm150)基因内抑制因子可改善发育迟缓现象，且位于束缚区域。(A) N2、isp-1(qm150)及某一区域（绿色背景标注）的发育情况。细胞色素bc1复合物的带状结构图中箭头指示束缚区域及P>S突变位置。
我们进行了一个正向遗传筛选，以鉴定isp-1(qm150)发育迟缓表型的抑制子（图1A）。在25°C下，isp-1(qm150)纯合子需要大约5天才能达到成年期，而N2（野生型）和抑制子突变体在2-3天内发育到成年期。使用甲磺酸乙酯/N-乙基-N-亚硝基脲诱变，筛选了约50,000个单倍体基因组，并分离出ISP-1内的八个独特的抑制子突变。这些品系与isp-1(qm150)连续回交三次，然后重新评估它们的表型。
为了确定每个抑制子对发育生长速率的相对影响，我们使用流式细胞术在25°C下量化了N2、isp-1(qm150)和抑制子品系的大小（图1B）。L1同步化的N2动物在铺板后约40小时达到成年期，而isp-1(qm150)动物需要约100小时才能发育到成年期。抑制子突变体在L1释放后55-75小时内都能达到成年阶段。
八个独特的基因内抑制子突变中有七个聚集在ISP-1的一个六个氨基酸区域(DQRALA)系链区域，该区域位于isp-1(qm150)品系中P到S突变上游73个残基处（图1C）。位置149（丙氨酸）的突变是我们筛选中最普遍的基因内抑制子突变。
表1.秀丽隐杆线虫MQ887 isp-1(qm150)背景下的抑制子突变
唯一一个在系链之外的基因内抑制子位于系链区域下游20个氨基酸处，sea8，R171（图1 C和D）。ISP蛋白的系链区域是高度保守的(17)（图1D和SI附录，图S1）。由于ISP-1系链区域中的丙氨酸残基高度保守，并且所有抑制子突变体的生长速率相对相似，我们进一步的分析集中在A149T/V（sea4和sea5用于同一残基的比较）和A151T（sea7用于另一残基的比较）上。
isp-1(qm150)发育迟缓的基因内抑制子也抑制繁殖力、运动性和泵送缺陷
图2. isp-1(qm150)抑制因子的生理参数。(A和B)N2、isp-1(qm150)及其中一个抑制因子在两种不同温度(20℃和25℃)下的繁殖数量，每个品系/条件n=25。(C)20分钟内的摆动次数。(D)咽泵速率，每个品系n=30，采用双尾异方差t检验对所有10种组合进行两两品系比较，以确定哪些泵速率差异具有统计学意义。(E)抑制因子在25°C下的寿命，所示结果为单次典型试验数据。N2(n=90)、isp-1(qm150)(n=65)、isp-1(qm150sea4)(n=53)、isp-1(qm150sea5)(n=158)、isp-1(qm150sea7)(n=198）。图表显示的是在实验过程中死亡的动物。离开琼脂表面的动物不计入统计。未进行其他数据审查。误差棒：突出显示实验的标准误（SEM），*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
与野生型相比，isp-1(qm150)突变导致繁殖力（繁殖力大小）显著降低(6)。我们在20°C和25°C下测量了携带sea4、sea5或sea7抑制子突变的iso-1(qm150)动物的繁殖力大小，发现所有三个抑制子品系产生的后代都显著多于isp-1(qm150)动物（图2 A）。同样，通过“摆动”（侧向游泳）测定评估，在sup突变体中观察到运动性增加（图2C）。与野生型秀丽隐杆线虫相比，isp-1(qm150)突变还导致咽部泵送速率和运动性显著降低。在所有检查的情况下，抑制子突变导致咽部泵送速率比isp-1(qm150)动物增加（图2D）。
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