摘要 本研究评估了脉冲光照（PL）处理后枯草芽孢杆菌的细胞可培养性丧失（孢子计数）、孢子发芽及随后的营养生长情况。PL对这些机制的影响取决于所施加的总能量密度，随着总能量密度的增加（0.3–12 J/cm²），孢子计数减少。暴露于低总能量密度（0.3 J/cm²）后，孢子发芽和营养生长均未受影响。
1至2 J/cm²之间的能量密度不会改变发芽速率，但会显著延迟细菌生长。生长前的滞后期随总能量密度的增加而延长。对于更高的总能量密度（5.5 J/cm²），孢子发芽速率显著降低。当枯草芽孢杆菌孢子受到12 J/cm²处理时，未检测到可培养细胞（达到最大可检测的细胞灭活水平），孢子发芽和营养生长均被抑制至少48小时。对于发生发芽的PL处理，除最低能量密度（0.5 J/cm²）外，在发芽早期阶段发现枯草芽孢杆菌细胞对PL的抵抗力暂时增加。在此时期之后，细胞变得更加敏感，在指数生长期和稳定生长期对PL具有相似的抵抗力。PL使枯草芽孢杆菌细胞（孢子或营养体形式）对后续热处理敏感，证明了热和PL的协同效应，指出了这种联合处理在微生物灭活方面的潜力。
引言
属于芽孢杆菌属的产孢细菌在环境中广泛分布，可从各种食品和食品生产原料中分离出来。这些微生物形式对多种胁迫具有极强的抵抗力，包括有毒化学品和杀菌剂、干燥、高压、热处理、紫外线加工或电离辐射。孢子抗性涉及多种因素，如低核心含水量、孢子核心中丰富的矿物质、DNA被α/β型小酸溶性蛋白（SASP）饱和、孢子结构以及孢子发芽和生长过程中的损伤修复。
然而，休眠孢子本身在食品中并不构成危害，因为它们的存在不会导致腐败和/或食物中毒，除非提供适合发芽和生长的环境。因此，有效灭活细菌孢子或抑制孢子发芽及随后营养生长的保存方法可能在食品工业中具有潜在应用，以提高食品产品的稳定性和安全性。热灭菌是灭活休眠孢子的有效工艺，但高温的使用会导致食品的营养、感官或技术特性发生实质性变化。因此，人们已做出重大努力开发非热技术，以防止不利的热效应并生产安全食品。
脉冲光照（PL）技术作为传统保存工艺的有前景的替代方案而出现。这项新技术由短持续时间、高功率的宽带发射光（190–1000 nm）闪光的连续重复组成，其中约40%的发射光对应于紫外区域。PL已被证明能有效灭活广泛的微生物，包括营养细胞和孢子。然而，由于发芽是孢子发挥其有害作用的关键步骤，对于其在食品工业中的应用，尚未阐明的一个重要因素是PL对这一代谢过程的影响。
因此，本研究的主要目标是评估PL对枯草芽孢杆菌孢子发芽及随后生长的影响。由于细菌孢子在发芽后对热更加敏感，本研究在孢子发芽和营养生长的不同阶段检查了暴露于不同能量密度的枯草芽孢杆菌细胞的热敏感性。此外，本研究在从孢子到营养细胞的转变及随后生长的不同阶段评估了该技术的影响，以确定枯草芽孢杆菌最易感的生理状态。
材料与方法
菌株和孢子生产
枯草芽孢杆菌DSM 10（德国微生物和细胞培养保藏中心）保存在-80°C的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，Pronadisa，西班牙）中，补充有20%（w/w）甘油溶液。解冻的储备培养物（100 μL）转移到10 mL TSB中，在30°C培养24小时。然后将每种细菌菌株以10³ CFU/mL接种，在30°C培养24小时直至早期稳定生长期（10⁷ CFU/mL）。
将500 μL细菌培养物等份涂布在营养琼脂（NA，Pronadisa，西班牙）上，补充有1 mg/L MnSO₄和0.5 g/L CaCl₂，然后在30°C孵育直至>90%的细胞形成孢子。通过相差显微镜观察折光性孢子来验证孢子形成。用无菌蒸馏水从琼脂平板上收获孢子。收集的孢子在4°C下以4000×g离心15分钟，并用无菌蒸馏水洗涤三次。通过混合死细胞和活细胞获得具有不同总密度和可培养孢子密度的混合孢子群体。死细胞经过PL处理（12 J/cm²；在第2.2和2.3节中描述），诱导最大灭活水平（>7 Log，数据见表1），并在30°C营养培养基（TSB）中孵育至少48小时避免营养生长。
脉冲光照设备
使用台式SBS-XeMaticA-(L+L)设备（SteriBeam Systems GmbH，德国）。抛光不锈钢处理反应器由一个垂直移动的石英架（用于固定样品；195×134 mm）组成，位于两个氙灯（上部和下部）之间。发射光谱包括190至1100 nm的波长，其中约20%的发射光在UV-C区域，8%在UV-B区域，12%在UV-A区域。使用风扇冷却系统防止灯和样品过热。
脉冲光照处理
将300 μL枯草芽孢杆菌孢子悬浮液（按上述方法制备）等份转移到无菌紫外透明Suprasil石英比色皿（光程1 mm，Hellma，德国）中，并立即在室温（23–25°C）下进行PL处理。样品放置在石英架中心，距离上部氙灯6 cm，在2.2 kV下处理。PL处理仅使用上部氙灯进行。
每脉冲能量密度用能量计（型号QE25-LP-H-MB，Gentec，加拿大）配合Solo2读数单元测量，并以每平方厘米焦耳表示。测量之间至少暂停30秒以防止探测器可能过热。所有能量密度测量均进行三次重复。总能量密度或每单位面积照射到样品上的光子量是影响PL微生物灭活的最相关工艺因素。因此，总能量密度（H）通过将脉冲能量密度乘以脉冲数（n）计算（H=H₀×n）。样品暴露于0.14–12 J/cm²范围的能量密度。每种处理条件至少重复三次。未处理的接种样品用作对照。
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