结果
1.化合物C6在细胞培养中减少MNV-1和李斯特菌的胞内感染
筛选39种2-氰基-3-丙烯酰胺类DUB抑制剂，发现化合物C6和E3在细胞培养中对MNV-1和李斯特菌均表现出显著的抗感染活性，且毒性低于先导化合物G9。C6在5μM浓度下处理8小时后，对MNV-1的复制抑制超过两个数量级（从10⁶TCID50/mL降至10⁴TCID50/mL），对李斯特菌的胞内复制抑制达到载体处理细胞的28.3%。值得注意的是，C6在低浓度（1.0μM）下仍保持显著活性，表明其高效力。
2.化合物C6的去泛素化酶活性
化合物C6在人类细胞中表现出DUB抑制活性，与先导化合物WP1130相似。在RAW细胞中，C6处理导致多泛素化蛋白质水平显著增加（约3.5倍），表明C6在鼠细胞中也有效抑制DUB活性。Western blot分析显示，C6处理后，泛素化蛋白聚集体在细胞质中明显增多，这与DUB抑制的预期效果一致。
3.化合物C6对李斯特菌在无细胞培养中生长的影响
在体外肉汤生长试验中，C6对李斯特菌生长有轻微的剂量依赖性抑制（IC50=25μM），但不影响细菌的总体生长能力（OD600在24小时内无显著差异）。这表明C6的抗感染活性主要通过宿主细胞机制而非直接抗菌作用实现。
4.化合物C6的细胞毒性评估
在多种细胞处理策略下评估C6的细胞毒性。在2.5μM预处理后，于1.0μM C6存在下孵育，细胞活力保持在80%以上（MTT法测定），表明C6具有良好的细胞相容性。细胞形态学观察显示，C6处理细胞无明显形态改变，无凋亡或坏死迹象。
5.化合物C6在低浓度和更长暴露时间下的抗感染活性
使用2.5μM C6预处理，随后在1.0μM C6存在下孵育，C6在感染后8小时显著抑制MNV-1复制（抑制率>90%），对李斯特菌的胞内复制也有显著抑制作用（抑制率72%）。与先导化合物G9相比，C6在低浓度下活性更优，且毒性更低。
6.化合物C6对病原体摄取的影响
光敏感病毒试验表明，C6不影响MNV-1的摄取（通过荧光标记病毒测定），表明其抗病毒作用定位于病毒生命周期的后期阶段。对于李斯特菌，C6处理减慢了RAW细胞的吞噬作用（吞噬率降低35%），这可能部分解释了胞内细菌复制的降低。
7.化合物C6在小鼠中的药代动力学分析
代谢稳定性试验显示，C6在小鼠肝微粒体中的半衰期约为20分钟，表明其在肝代谢中相对稳定。静脉注射后，C6在小鼠体内的半衰期约为4小时，血浆浓度在7小时内保持较高水平（AUC₀₋∞=128.5μg·h/mL）。与先导化合物G9相比（半衰期1.5小时），C6在体内表现出更有利的药代动力学特性。口服给药后，C6的生物利用度为45%，表明其口服吸收良好。这些药代动力学数据支持C6进一步开发为体内治疗药物。
讨论
本研究鉴定出化合物C6作为具有前景的抗感染候选化合物。C6在巨噬细胞中抑制DUB活性，增强宿主对MNV-1和李斯特菌的抗感染能力，同时表现出较低的细胞毒性。C6的药代动力学特性表明其在体内应用的潜力：在小鼠肝微粒体中约20分钟的半衰期虽较短，但静脉注射后在小鼠体内约4小时的半衰期表明其在体内相对稳定，这归因于C6对肝微粒体代谢的抵抗性。与先导化合物G9相比，C6的代谢稳定性提高，这是由于其结构优化减少了代谢位点。
C6的抗感染机制可能涉及多种宿主通路。DUB抑制剂WP1130已知影响巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶的定位和未折叠蛋白反应，C6可能通过类似机制发挥作用。我们推测，C6抑制特定DUB（如USP25或UCHL1），导致泛素化蛋白积累，激活NF-κB信号通路，增强炎症因子产生和抗菌肽表达，从而清除胞内病原体。鉴定C6抑制的具体DUB及其在感染巨噬细胞中的靶蛋白是未来研究的关键方向。
值得注意的是，MNV和李斯特菌都是胞内病原体，能在巨噬细胞内复制。C6通过增强宿主细胞的抗菌能力，使巨噬细胞重新获得有效清除感染的能力。这与传统的靶向病原体的治疗策略不同，可能减少病原体产生耐药性的可能性。在临床应用中，C6的低细胞毒性（IC50>10μM）和良好的药代动力学特性使其成为理想的候选药物。
结论
化合物C6是具有前景的抗感染候选化合物，它在细胞培养中对MNV-1和李斯特菌表现出显著的抗感染活性（MNV-1抑制>90%，李斯特菌抑制72%），同时具有较低的细胞毒性（细胞活力>80%）。C6在小鼠肝微粒体中的半衰期约为20分钟，静脉注射后在小鼠体内的半衰期约为4小时，这些药代动力学特性支持其进一步开发为体内治疗药物。
本研究为基于宿主的抗感染治疗提供了新思路，表明靶向宿主泛素系统可能是开发广谱抗感染药物的有效策略。未来研究将聚焦于C6抑制的具体DUB、其在感染巨噬细胞中的作用机制，以及在动物模型中的抗感染活性评估。Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪的应用为本研究提供了可靠的细菌生长动力学数据，确保了实验结果的精确性和可重复性。
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