抗菌耐药性测定
每个采样日期检测12至58个菌落的耐药性，采用纸片扩散法在纸片培养基（PDM）琼脂上进行，遵循瑞典抗生素参考小组的建议。大肠菌群细菌检测对环丙沙星（CIP）、亚胺培南（IMI）和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（TS）的耐药性。肠道肠球菌检测对CIP、氨苄西林（AMP）、万古霉素（VAN）和IMI的耐药性。使用以下纸片浓度：CIP 5 mg；AMP 10 mg；VAN 5 mg；IMI 10 mg；TS 25（23.75+1.25）mg。
在37°C下孵育24±3小时后测量抑菌圈直径，并根据相应的折点将分离株分类（表1所示）。同时，通过将沉淀物样品涂布于选择性培养基上评估耐药推定肠球菌和大肠菌群细菌的频率，培养基含或不含相当于各生物MIC浓度的抗菌药物（表1），如上所述。耐药频率表示为含抗菌药物琼脂上CFU ml⁻¹与不含抗菌药物琼脂上CFU ml⁻¹的比值。
表1：纸片扩散法的敏感(S)、中间(I)和耐药(R)分类折点以及涂布平板法的耐药分类最小抑菌浓度(MIC)折点| 抗菌药物 | 纸片浓度(μg) | 抑菌圈直径折点(mm) | MIC折点(mg l⁻¹ 琼脂) | ||
| 大肠菌群 | 肠球菌 | 大肠菌群 | 肠球菌 | ||
| 氨苄西林 | 10 | 20/16 | - | 8 | |
| 亚胺培南 | 10 | 23/16 | 20/16 | 8 | 8 |
| 万古霉素 | 5 | 11/9 | 1 | ||
| 环丙沙星 | 5 | 24/17 | 32/12 | 1 | 1 |
| 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 | 25 | 17/13 | 32 | ||
耐药分离株分型
使用PhenePlate™ PhP-RF系统对通过纸片扩散法分类为耐药的肠道肠球菌分离株进行分型。耐药大肠菌群细菌使用PhenePlate™ PhP-RS系统进行分型。这些系统基于11种碳水化合物的发酵动力学为每个分离株提供生化指纹。通过将PhP谱型与同时运行的参考菌株比较，为分离株赋予身份。
生长评估
从CIP耐药类（R）、CIP中间类（I）和CIP敏感类（S）（基于透明圈直径，表1）中各选3个肠道肠球菌分离株，共9个，进行生长评估。使用全自动微生物生长曲线分析仪Bioscreen C，在37°C下测定Luria Bertoni肉汤中OD 600 nm处的滞后期和对数期世代时间。世代时间相对于用平板计数验证的标准曲线计算。
数据分析
使用PhP系统软件计算耐药分离株之间的Simpson多样性指数，相似性用同一软件产生的树状图说明（PhPlate）。统计分析在SigmaStat 3.0中进行，使用z检验进行频率分析和ANOVA，所有成对多重比较程序（Holm-Sidak法）。
结果
通过纸片扩散法，273个检测的大肠菌群分离株中有9个耐药，对CIP、IMI和TS的耐药率分别为1.1%、2.2%和2.2%（表2）。没有分离株对两种或以上物质耐药。2002年1月的5个TS耐药分离株具有相同表型，但通过PhP分型无法验证分离株之间的密切关系（Simpson多样性指数0.972；数据未显示）。筛选法给出的耐药频率为<0.1%至5.4%（表2）。肠道肠球菌纸片扩散法的结果见表3。未检测到万古霉素耐药肠球菌（N=158）。检测到的最高频率是对CIP的耐药，158个分离株中有21个（13%）耐药。在两个采样时间点（2001年8月30日、10月24日）发现显著更高的耐药分离株频率（P<0.05）。使用筛选法也在两个时间点检测到显著更高的CIP耐药频率（P<0.05），但采样日期不同（表3）。
表2：通过PDM琼脂纸片扩散法检测的耐药大肠菌群分离株(/总分离株)以及通过含与不含抗菌药物的LES endo琼脂上CFU ml⁻¹比值确定的耐药大肠菌群百分比(%)，抗菌药物浓度对应于表1| 采样日期 | 环丙沙星 | 亚胺培南 | 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑 | |||
| PDM | LES | PDM | LES | PDM | LES | |
| 2000年12月13日 | 0/44 | 1.4 | 0/44 | <0.1 | 0/44 | 0.7 |
| 2001年2月15日 | 2/43 | <0.1 | 1/43 | <0.1 | 0/43 | 0.2 |
| 2001年4月17日 | 0/58 | 1.1 | 3/58 | <0.1 | 0/58 | 3.4 |
| 2001年6月7日 | 0/16 | ND | 0/16 | ND | 0/16 | |
| 2001年8月30日 | 0/46 | ND | 0/46 | ND | 0/46 | 6 |
| 2001年10月24日 | 0/34 | <0.1 | 1/29 | <0.1 | 1/29 | 5.4 |
| 2002年1月24日 | 1/37 | <0.1 | 1/37 | 0.1 | 5/37 | 3.8 |
| 总计 | 3/273 | 6/273 | 6/273 | |||
使用肠球菌PhP系统对CIP耐药分离株进行表型分型，产生的多样性指数为0.947（图2）。然而，可以识别出两个簇。其中一个包含同一采样时间点的分离株，而另一个簇包含来自三个不同采样点（4月、8月和10月）的分离株（图2）。
图2. 样本日期时环丙沙星耐药性粪便肠球菌PhP分型所得树状图。
从三个CIP耐药类别（R、I、S）中各选3个肠道肠球菌分离株，进一步评估其在不同CIP浓度中的生长。敏感分离株在无抗生素培养基中直至CIP浓度1000 mg l⁻¹的滞后期显著更短。在500 mg l⁻¹时，S生长显著慢于R和I（P<0.01）。在1000 mg l⁻¹时，R具有最快的生长速率，在4000 mg l⁻¹时只有耐药分离株能够生长（表4）。
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