摘要
SOS反应是细菌细胞应对DNA损伤的范例。然而，一些细菌缺乏SOS调节因子LexA的同源物，包括革兰氏阳性菌乳酸乳球菌。在该生物体中，我们鉴定出一种负性转录调节因子HdiR，它在DNA损伤和热激条件下均能诱导靶基因表达。凝胶迁移率变动实验表明，HdiR的结合位点位于一个反向重复结构内。HdiR在体外高pH条件下能够进行自切割反应，而在体内，它在DNA损伤剂存在时发生RecA依赖性的自切割。有趣的是，HdiR的N端切割产物保留了DNA结合活性，只有在被Clp蛋白酶降解后，基因表达才被诱导。因此，HdiR响应DNA损伤的活性受到顺序性蛋白水解作用的控制，包括自切割和Clp依赖的HdiR降解。在热应激期间，发生有限的自切割；然而，recA和clpP仍然是靶基因表达完全诱导所必需的。因此，我们的数据表明，HdiR调节子的DNA损伤诱导和热介导诱导涉及共同的元件。
引言
修复DNA的能力是所有生物的基本特征。DNA损伤诱导参与DNA复制、修复和诱变作用的基因表达，虽然无误途径修复了大部分损伤，但消除某些损伤本质上是诱变的。对革兰氏阴性菌大肠杆菌的广泛研究建立了当前SOS反应的范例。在生理条件下，SOS调节子被结合在靶基因启动子区域共有结合位点的LexA所抑制，包括lexA自身、recA和umuDC操纵子。DNA损伤时，RecA结合到复制受阻产生的单链DNA区域，导致核蛋白丝的形成。激活的RecA*具有重组酶和辅蛋白酶活性，后者是LexA、SOS诱变蛋白UmuD以及几种噬菌体阻遏蛋白自切割所必需的。RecA*促进的自切割发生在LexA的Ala84和Gly85残基之间，导致阻遏物活性失活和SOS调节子的诱导。在没有RecA*的情况下，LexA在高pH下被切割，证明该蛋白确实能够进行自切割。
大部分SOS诱变是由umuDC操纵子编码的DNA聚合酶V引起的。当复制叉遇到无法修复的损伤时，需要跨过复制阻滞进行易错复制，DNA聚合酶V执行跨损伤合成。PolV复合物由一个UmuC分子和两个激活的UmuD分子组成，后者由天然UmuD在类似于LexA自切割的反应中自切割产生。由于PolV的活性是诱变的，因此采用复杂的机制将Umu蛋白水平保持在最低限度。在转录水平，umuDC操纵子的表达受LexA严格调控，而在翻译后水平，无诱变活性和有诱变活性形式的UmuD的量分别由Lon和ClpXP蛋白酶控制。由蛋白水解亚基ClpP与ATP酶ClpX关联组成的ClpXP复合物也参与降解LexA的自切割片段。在最近的一份报告中，ClpXP对LexA N端片段的降解被证明对大肠杆菌在DNA损伤期间的生存很重要，这被认为是保留了一些阻遏物活性的结果。
在大肠杆菌以外的生物中，SOS反应途径的诱导和调控了解较少。在几种细菌中检测到SOS样反应，迄今为止鉴定的LexA同源物在功能上似乎是保守的。然而，LexA调节子的组成以及调控表现出巨大的多样性。在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌中，SOS反应的诱导基本上以类似于大肠杆菌的方式发生，但在感受态发育期间，ComK可以减轻LexA对recA基因表达的抑制而不置换LexA。这个过程由ATP依赖性蛋白水解复合物ClpCP对ComK的蛋白水解控制，该复合物由ATP酶ClpC和ClpP组成。ClpCP蛋白酶也降解枯草芽孢杆菌中的热激调节因子CtsR。除了大肠杆菌中的LexA，新月柄杆菌中的细胞周期调节蛋白CtrA和利迪链霉菌中的转录激活因子PopR也被证明是ClpP的底物。然而，关于ClpP介导的降解在其他原核生物基因调控方面的作用知之甚少。
在本研究中，我们从革兰氏阳性菌乳酸乳球菌中鉴定出一种新型的LexA样阻遏物HdiR，它在单个调节分子中协调对DNA损伤和热激的响应。
实验步骤
细菌菌株、质粒、寡核苷酸和培养条件
本研究中使用的菌株和质粒列于表1。使用的寡核苷酸作为补充材料提供。乳酸乳球菌菌株在补充了0.5%葡萄糖的M17培养基中于30°C培养。需要时，在生长培养基中添加氯霉素或四环素。大肠杆菌菌株在补充了氨苄青霉素和/或卡那霉素的LB培养基中于37°C培养。
表1. 细菌菌株和质粒。
| 菌株或质粒 | 相关表型或基因型 |
|---|---|
| 菌株 | |
| 大肠杆菌 | |
| TOP10F' | F' {laclq Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG |
| M 15[pREP4] | NaIs Strs rifs thi- lac- ara+ gal+ mtl- F- recA+ uvr+ lon+，携带pREP4质粒 |
| 乳酸乳球菌 | |
| IL1403 | 无质粒菌株 |
| MG1363 | NCDO712的质粒及前噬菌体消除衍生物 |
| PV114 | 表达缺失HTH基序hdiR的MG1363衍生物 |
| DFΔclpP | MG1363 ΔclpP |
| VEL1122 | MG1363 recA::tet |
| KS73 | 携带pKS47质粒的MG1363 |
| KS74 | 携带pKS47质粒的PV114 |
| KS78 | 携带pKS49质粒的MG1363 |
| KS79 | 携带pKS49质粒的DFΔclpP |
| KS80 | 携带pKS49质粒的VEL1122 |
| PV121 | 携带pKS50质粒的MG1363 |
| PV122 | 携带pKS50质粒的PV114 |
| 质粒 | |
| pCR2.1 | Amr，用于直接克隆PCR扩增产物的载体 |
| pCI372 | Cmr，大肠杆菌-乳酸球菌穿梭载体 |
| pGhost8 | Tetr，pGK12的温度敏感型衍生物 |
| pQE-30 | Amr，用于过表达带N端His(6)标签蛋白的载体 |
| pBluescript-II SK+ | Amr，克隆载体 |
| pQE-hdiR | Amr，用于过表达His标签HdiR的pQE衍生物 |
| pKS36 | Amr，携带hdiR 0.7 kb PCR片段的pCR2.1 |
| pKS46 | Tetr，携带1.1 kb XbaI-SalI片段（含有hdiR基因内64 bp框内缺失）的pGhost8 |
| pKS47 | Cmr，携带1.0 kb XbaI-SalI片段（含有hdiR基因区域）的pCI372 |
| pKS49 | Cmr，携带0.93 kb EcoRI-SalI片段（含有ctsR启动子和hdiR结构基因）的pCI372 |
| pKS50 | Cmr，携带1.78 kb BamHI-EcoRI片段（含有来自IL1403的umuC基因区域）的pCI372 |
| pBluescript-IR1 | Amr，携带含有hdiR基因前IR1的22 bp片段的大肠杆菌载体 |
| pBluescript-IR2 | Amr，携带含有hdiR基因前IR2的22 bp片段的大肠杆菌载体 |
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