1、材料与方法
1.1菌株来源及培养条件
实验所用的食源性致病菌菌株[原始数据存储在国家微生物科学数据中心，编号为NMDCX0002088]购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其余菌株则保藏于宁波大学海洋生物病毒研究室菌种库。LB半固体培养基：琼脂的质量分数为0.75%的LB培养基；LB固体培养基：琼脂的质量分数为1.5%的LB培养基。培养条件：37℃、150 r/min。
1.2噬菌体的分离纯化
于浙江省宁波市北仑区路林市场(29.906 300°N，121.605 903°E)下水道采集表层水样(2023年04月25日)，低温运送至实验室后在4℃、8 000×g离心10 min，取上清依次经0.45μm和0.22μm孔径的聚醚砜滤膜过滤。取CICC 10869用LB肉汤培养基培养至对数期(OD600≈0.6)。为了富集噬菌体，将40 mL对数期菌液、40 mL上述水样滤液和40 mL 3×LB液体培养基于锥形瓶中混合，37℃、150 r/min培养3 h；同期将40 mL对数期菌液、40 mL纯水和40 mL 3×LB的混合液作为对照组培养。将实验组裂解澄清的培养液在4℃、8 000×g离心10 min，取上清液依次经0.45μm和0.22μm孔径的聚醚砜滤膜过滤，得到的过滤液即为噬菌体富集液。
采用双层琼脂平板法进行噬菌体纯化，3代后获得形态、大小均一的噬菌斑。挖取单个噬菌斑至5 mL新鲜培养的CICC 10869菌液中，37℃、150 r/min培养至裂解澄清，同期设置未加噬菌斑的菌液作为对照组。
Yen-yong1在菌苔上形成的透明噬菌斑周围具有半透明晕圈(halo)。噬菌体透明噬菌斑周围的半透明晕圈是由于晕圈所在位置的细菌在未被噬菌体感染时，其胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)被噬菌体的自由扩散的解聚酶降解造成的。噬菌斑周围是否具有半透明晕圈被认为是判断噬菌体是否具有解聚酶(depolymerase)的最直观方法。解聚酶通常具有高耐热性，而噬菌体通常不耐高温，可以基于如下原理进行解聚酶活性验证：将噬菌体悬液高温(如70℃)处理以灭活噬菌体后，点至菌平板上孵育，如噬菌体有解聚酶则会在菌苔上相应区域形成半透明的晕圈。因此，进一步检测Yen-yong1的解聚酶活性：将噬菌体Yen-yong1悬液在70℃下孵育30 min使Yen-yong1灭活，然后滴至CICC 10869琼脂平板上(2.5μL/点)进行点斑实验，观察是否在菌苔上形成半透明晕圈。
1.3噬菌体的形态学观察
取新鲜培养的噬菌体-菌裂解液滴至铜网(200目)上，静置10 min后用中性滤纸吸去多余水分，用2%乙酸铀酰负染色30 s，用中性滤纸吸去多余染色剂，静置10 min后在透射电镜(Hitachi公司)下观察噬菌体形态。
1.4噬菌体的基因组提取与测序
进行噬菌体的基因组提取、测序与拼接。取噬菌体-菌裂解液离心、过滤后，取上清液滤液，加入DNase I和RNase A酶解污染的宿主核酸后，采用经典的酚/氯仿法提取噬菌体DNA，用NEBNext UltraⅡDNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs,NEB公司)按照说明书构建基因组文库。使用Illumina PE300试剂盒，在Illumina MiSeq上进行测序，用Trimmomatic v0.36软件去除低质量值的测序reads(Q-value<20)，使用SPAdes v3.13.0软件对过滤后的数据进行拼接。
1.5噬菌体基因组注释
使用童贻刚教授团队研发的方法和软件PhageTerm对噬菌体基因组的末端进行分析。
使用在线工具RAST对噬菌体Yen-yong1的基因组进行初步的开放阅读框(open reading frames,ORFs)预测与注释。在此基础上，使用BLASTp、HHpred和HMMER对预测的所有ORFs进行验证和校准。使用PerL语言脚本构建噬菌体的基因图谱(genome map)，并用Inkscape作图软件对矢量图进行美化。
使用在线工具tRNAscan-SE对噬菌体基因组中的tRNA进行在线预测。
使用VFDB数据库检测噬菌体基因组中是否含有毒力因子基因。
用CARD数据库分析噬菌体基因组中是否含有耐药基因。
1.6噬菌体系统进化地位分析
使用NCBI提供的BLASTn搜索与Yen-yong1基因组同源的序列，所选数据库为nucleotide collection。
使用PASC计算公共数据库中的所有病毒与Yen-yong1基因组间的成对核苷酸序列相似度值(PASC值)。
使用在线工具ViPTree，基于tBLASTx计算的全基因组序列相似性，以公共数据库中所有病毒基因组(共7 002株)作为参考序列与Yen-yong1一同构建总蛋白谱系统进化树(proteomic tree)。在此基础上，选取在总进化树中与Yen-yong1进化距离最近的3株病毒(Escherichia phage HK639、Cronobacter phage phiES15、Aeromonas phage pAEv1818)、在BLASTn和PASC比对中与Yen-yong1相似性最高的病毒、在国际病毒分类委员会(ICTV)分类系统中各单元中的代表性噬菌体以及在ICTV中有分类地位的11株小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体的基因组作为参考序列，构建精细蛋白谱系统进化树。用Inkscape作图软件对矢量图进行美化。
使用在线工具EzBioCloud中的ANI Calculator工具计算Yen-yong1和在进化树中与之进化距离最近的3株病毒之间的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)。使用在线工具Genome-to-Genome Distance Calculator计算Yen-yong1和在进化树中与之进化距离最近的3株病毒之间的DNA分子原位杂交值(in silico DNA-DNA hybridization,isDDH)。使用在线工具The virus intergenomic distance calculator计算Yen-yong1与进化树中进化距离最近的3株病毒的基因组间的成对基因组间相似性(VIRIDIC值)。
用Easyfig软件[30]构建Yen-yong1和与之亲缘关系最近的噬菌体之间的基因组相似性比较图。
使用在线工具VirClust分析Yen-yong1与近源噬菌体间共享的核心基因(core gene)。
1.7宿主范围和成斑率(efficiency of plating,EOP)测定
采用点斑法检测Yen-yong1的宿主范围，供试菌共65株(编号为NMDCX0002088)。分别将200μL对数期菌液(2.38×107 CFU/mL)与4 mL LB半固体培养基混匀，倾倒在LB固体培养基上，制成双层琼脂平板。凝固后，在平板上等间隔滴加噬菌体悬液(2.5μL/点，1.95×109 PFU/mL)。将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养12 h。若试验平板上出现明显的透明噬菌斑，则认为噬菌体裂解该菌株，为阳性结果；反之则认为噬菌体不能裂解该菌株，为阴性结果。每个菌株重复3次点斑实验。参照文献[32]，采用双层琼脂平板法测定Yen-yong1(1.95×109 PFU/mL)在各个宿主菌株菌苔上出现的噬菌斑数，以在指示菌株CICC 10869菌苔上出现的平均噬菌斑数为分母，以其他易感菌菌苔上的噬菌斑数为分子，计算Yen-yong1在其他易感菌的成斑率。EOP实验重复3次。
1.8噬菌体的一步生长曲线
参照文献[33-34]测定Yen-yong1对指示菌CICC 10869的最佳感染复数(optimal multiplicity of infection,MOI)和最佳吸附时间。
取新鲜培养的CICC 10869对数期菌液(OD600≈0.6)与Yen-yong1按最佳MOI(MOI=1)混合，置于37℃恒温培养箱中按照最佳吸附时间孵育6 min。将混合物4℃、8 000×g离心10 min，用LB液体培养基洗涤2次后，将沉积物重悬于等体积的LB液体培养基中，37℃、150 r/min培养，分别于0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240 min取样。采用双层琼脂平板法检测样品中噬菌体滴度。上述实验重复3次。参照文献[35]计算噬菌体的暴发量(burst size)，如公式(1)所示。
暴发量(PFU/cell)=暴发期结束时游离的噬菌体数/潜伏期开始时感染的细菌细胞数(1)
1.9噬菌体的理化稳定性
1.9.1酸碱敏感性检测
取Yen-yong1悬液(2.00×109 PFU/mL)分装成1 mL/管，用NaOH或HCl分别将其调至pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，于37℃孵育2 h后取样。
1.9.2盐度敏感性检测
分别配制NaCl质量分数为0、1%、3%、5%、7%和9%的LB固体培养基和LB半固体培养基。分别取4 mL各盐浓度的半固体LB培养基与100μL Yen-yong1悬液(4.47×108 PFU/mL)、200μL对数期CICC 10869(2.23×107 CFU/mL)菌液充分混合后，立即倾倒至相应盐浓度的LB固体培养基上，冷却后倒置于培养箱(37℃)中培养12 h后进行噬菌斑计数，计算噬菌体滴度。
1.9.3温度敏感性检测
取Yen-yong1悬液(3.70×109 PFU/mL)分装成1 mL/管，分别置于-80、0、25、40、50、60、70和80℃孵育，分别于0、30、60、90和120 min取样。
1.9.4噬菌体长期保存条件检测
取新鲜培养的充分裂解的噬菌体-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)分装成1 mL/管，分别于-80、-20、25(室温)和4℃存放，用于检测温度对噬菌体活性的影响。在0-360 d中每隔30 d取样检测噬菌体滴度，每次每样取3个平行管。在该种操作下，每个存于-80℃和-20℃的样品均只冻融1次。
为了检测多次冻融是否影响噬菌体滴度，取新鲜培养的充分裂解的噬菌体-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)装于50 mL无菌EP离心管中(40 mL/管)，分别存放于-80℃和-20℃，用于检测在该温度下冻存次数对噬菌体活性的影响。在0-360 d中每隔30 d化冻、取样检测噬菌体滴度，每次每样取3个平行管。
采用双层琼脂平板法测定样品的噬菌体滴度。每个实验重复3次。
1.10噬菌体对细菌生物被膜的清除能力
1.10.1细菌生物被膜形成能力检测
采用结晶紫染色法[36]测定易感细菌的生物被膜形成能力。分别将易感菌株接种到5 mL LB液体培养基中，37℃、150 r/min培养16 h。取100µL培养液加入到10 mL LB液体培养基中进行稀释。实验组分别取500μL稀释菌液加入到48孔细胞培养板中，对照组则加入500μL LB液体培养基，将培养板置于恒温培养箱中37℃培养24 h。然后用枪头吸去培养孔中的液体，用0.01 mol/L PBS洗涤培养孔3次。在每个培养孔中加入500μL甲醇固定30 min，弃去甲醇并在室温下干燥；在每个培养孔中加入500μL质量分数为1%的结晶紫于室温下对生物被膜染色30 min，用无菌水(ddH2O)洗涤培养孔3次，在室温下干燥。随后向每孔加入500μL体积分数为33%的冰醋酸。使用酶标仪测定OD590值。上述实验重复3次。
细菌生物被膜形成能力判定标准分为强(4×ODc≤ODt)、中等(2×ODc<ODt≤4×ODc)、弱(ODc<ODt≤2×ODc)和无生物被膜形成(ODt≤ODc)这4个水平。其中，ODc和ODt分别为对照组和实验组的OD590值。
1.10.2噬菌体对细菌生物被膜的清除能力
参照文献[36]测定噬菌体对细菌生物被膜的清除能力。按照细菌生物被膜形成能力检测方法(1.10.1节)培养各易感细菌的生物被膜，实验组每孔加入500μL噬菌体Yen-yong1悬液(1.85×109 PFU/mL)，对照组加入等体积的LB，置于37℃恒温培养箱中培养2 h。然后按照1.10.1节的步骤进行结晶紫染色和OD590测定。上述实验重复3次。
1.11噬菌体对生猪肉中病原菌的控制
为检测Yen-yong1对生猪肉中污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌的去除效果，分别在25℃和4℃下进行了细菌清除实验。
从市场购买新鲜生猪肉500 g，用75%乙醇浸泡1 min以消毒表面。在超净工作台中取出并晾干后，用无菌解剖刀切除表层，切成大小均一的肉片(1 cm×1 cm×0.5 cm)，置于带盖无菌培养皿中。取新鲜培养的对数期小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液，均匀滴加于生猪肉片表面(20μL/片，2×107 CFU/mL)，随机将其分成两组。实验组分别按照不同MOI(MOI=1、10、100)均匀滴加噬菌体Yen-yong1悬液(20μL/片，2×107、2×108、2×109 PFU/mL)，对照组均匀滴加20μL LB液体培养基。再次将实验组与对照组均分为两组，分别置于室温(25℃)和冷藏室(4℃)，以模拟猪肉在市场销售和贮运的条件。对室温放置的猪肉片分别于0 h和3 h取样；对冷藏的猪肉片分别于0 h和24 h取样。由于屠宰的生猪通常为冷藏运输、储存和出售，只有部分菜场会将少量猪肉置于常温短期摆放，因此4℃下的实验取样时长为24 h，而25℃下为3 h。将取得的肉片样品分别置于无菌EP管中，加入1 mL LB液体培养基，研磨后采用标准平板计数法检测细菌数量。每组设置3个平行。细菌清除率计算如公式(2)所示。
细菌清除率=(对照组小肠结肠炎耶尔森氏菌平均浓度-实验组小肠结肠炎耶尔森氏菌平均浓度)/(对照组小肠结肠炎耶尔森氏菌平均浓度)×100%(2)
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