材料与方法

菌株和培养。研究了代表不同脉冲场凝胶电泳类型的24株II组肉毒梭菌菌株（3株B型，16株E型，5株F型）。使用如下所述的扩增片段长度多态性对菌株进行基因分型，并通过多重PCR assay确认肉毒神经毒素基因的携带。

所有肉毒梭菌菌株均从孢子接种在血琼脂平板上培养。将每个菌株的三个不同菌落分别接种到10毫升TPGY肉汤中，并在30°C下培养24小时。将每种培养物的100微升样品进一步接种到10毫升新鲜TPGY肉汤中，并在30°C下培养16小时。所有培养物均在厌氧工作站中制备。研究中使用的琼脂平板和肉汤在使用前分别通过厌氧储存48小时和煮沸15分钟进行脱氧处理。

最低和最高生长温度。使用GradiplateW10温度梯度培养箱测定II组肉毒梭菌菌株的最低和最高生长温度。将每种稳定期培养物的100微升样品接种到10毫升TPGY肉汤中，并在30°C下培养至OD600达到0.6至0.9光密度单位。然后将每种对数期培养物的1毫升样品用9毫升蛋白胨水稀释，并将25微升稀释培养物通过液滴流动技术纵向接种到厌氧TPGY琼脂平板上。每个菌株接种两个重复培养物。温度梯度分别设置为3至9°C和33至42°C以确定最低和最高生长温度。低温下的生长边界在培养28天后通过立体显微镜确定，而高温下的生长边界在培养48小时后通过肉眼确定。生长边界计算为细菌密集生长停止的边缘。技术重复获得的值取平均值。实验进行三次。每个菌株的最低和最高生长温度记录为三次重复实验的平均值。

在10°C、30°C、37°C和40°C下的最大生长速率。将30°C培养的第二次过夜培养物的100微升样品接种到10毫升厌氧TPGY肉汤中并混合，然后将此稀释液的350微升移液到100孔微孔板的四个重复孔中，并在厌氧工作站中使用Bioscreen C微生物生长曲线分析仪在10°C、30°C、37°C或40°C下培养。培养物在连续振荡下培养48小时或14天。培养物的OD600值由Bioscreen微生物生长曲线分析仪自动测量并每15分钟报告一次。通过绘制OD600随时间变化的曲线获得生长曲线。通过将生长曲线拟合到Baranyi和Roberts模型，使用DMfit Microsoft Excel插件程序确定每种培养物的最大生长速率，并计算四个技术重复的平均值。实验进行三次。计算三次重复实验在10°C、30°C、37°C和40°C下的平均最大生长速率。计算每个菌株在两个温度下的平均最大生长速率之间的差异。

AFLP分析。AFLP分析按照Keto-Timonen等人描述的方法进行。

统计分析。使用SPSS 15.0 for Windows中的Student's t检验，比较代表不同毒素类型或不同AFLP簇的菌株组在最低和最高生长温度以及10°C、30°C、37°C和40°C下的最大生长速率。

结果

最低和最高生长温度。在我们实验系统中研究的24株II组肉毒梭菌菌株的最低生长温度范围为6.2°C至8.6°C，培养28天后的平均值为7.3°C。各毒素类型菌株的平均最低生长温度为：B型7.0°C，E型7.1°C，F型7.8°C。F型菌株的最低生长温度高于E型或B型菌株。在毒素类型内，E型菌株的变异最大，其最低生长温度范围为6.3°C至8.6°C。

图1 24株II组肉毒梭菌菌株的生长温度范围。阴影条代表生长温度范围。最低和最高生长温度为三次重复实验的平均值。菌株按温度范围大小排序，菌株名称后的括号内标明毒素类型

表2. 24株II组肉毒梭菌的最低与最高生长温度及其差值

毒素类型	菌株数量	菌株	平均±标准差生长温度(°C)		温度差(°C)
			最低	最高
B	3	所有B型菌株	7.0±0.9	36.6±1.9	29.6
		BL 90/4	8.0±0.6	38.5±0.7	30.5
		BL 93/6	6.2±0.5	36.4±0.6	30.2
		Eklund 17	6.8±0.0	34.7±0.7	27.9
E	16	所有E型菌株	7.1±0.6	39.0±0.8	31.9
		K3	6.3±0.5	38.7±1.0	32.4
		K8	6.9±1.1	39.2±0.3	32.3
		K35	6.3±1.4	39.3±0.7	33.0
		K36	6.8±0.6	39.6±0.1	32.8
		K42	6.5±0.2	38.4±0.3	31.9
		K44	7.2±1.2	39.3±0.3	32.1
		K51	7.8±0.4	37.4±0.6	29.6
		K101	6.6±0.0	37.8±0.6	31.2
		K117	7.1±0.4	39.9±0.3	32.8
		K119	7.3±0.4	39.8±0.7	32.5
		K125	7.3±0.3	38.6±0.3	31.3
		S16	7.8±1.0	39.5±1.0	31.7
		Beluga	7.7±0.2	38.2±0.1	30.5
		CB11/1-1	8.6±0.2	39.6±0.5	31.0
		BL 93/8	6.6±1.0	39.2±0.6	32.6
		31-2570	7.2±0.7	39.8±0.8	32.6
F	5	所有F型菌株	7.8±0.5	37.8±0.6	30.0
		BL 86/32	7.8±0.2	37.6±0.3	29.8
		BL 86/33	7.8±0.7	38.0±1.0	30.2
		BL 86/34	8.4±0.1	37.0±1.3	28.6
		610B8-6	8.0±0.2	38.0±0.5	30.0
		202	7.1±1.5	38.6±0.7	31.5
所有类型	24	所有菌株	7.3±0.7	38.5±1.2	31.2

所有研究的II组肉毒梭菌菌株的最高生长温度范围为34.7°C至39.9°C，平均为38.5°C。B型菌株的最高生长温度范围为34.7°C至38.5°C，平均为36.6°C；E型菌株为37.4°C至39.9°C，平均为39.0°C；F型菌株为37.0°C至38.6°C，平均为37.8°C。B型和F型菌株的最高生长温度显著低于E型菌株。B型和F型菌株之间的最高生长温度无显著差异。B型菌株在最高生长温度上的变异最大，最高值和最低值相差3.8°C。F型菌株的变异最小，最高和最低最高生长温度相差1.6°C。

图2： 在10°C(A)、30°C(B)、37°C(C)和40°C(D)下生长差异最大的II组肉毒梭菌菌株的生长曲线。虚线表示最大生长速率最低的菌株，实线表示最大生长速率最高的菌株。光密度在600纳米波长下测量（以光密度单位[ODU]表示）。

在10°C、30°C、37°C和40°C下的最大生长速率。所检测的II组肉毒梭菌菌株的最大生长速率范围在10°C时为0.01至0.05 ODU/h，在30°C时为0.29至0.44 ODU/h，在37°C时为0.06至0.45 ODU/h，在40°C时为0.00至0.13 ODU/h。所有菌株在10°C时的平均最大生长速率为0.02 ODU/h，在30°C时为0.36 ODU/h，在37°C时为0.25 ODU/h，在40°C时为0.06 ODU/h。在40°C时，仅观察到11株菌生长，这些菌株均为毒素E型。在37°C时，E型菌株的生长速率显著高于其他菌株。E型菌株K51和K101，F型菌株610B8-6、BL 86/32和BL 86/34，以及所有三株B型菌株在37°C时的生长显著慢于30°C。虽然比较30°C和37°C的最大生长速率显示，五株E型菌株在37°C的最大生长速率高于30°C，但此差异不显著。研究中包含的其余菌株之间生长速率无显著差异。

表3. 第二组肉毒杆菌菌株在10、30、37及40℃条件下的最大生长速率（GR）及其差异比较（ΔGR10-30与ΔGR37-30）

毒素类型	菌株数量	菌株	平均±标准差最大生长速率(ODU/h)在以下温度下：					生长速率差(ODU/h)
			10°C	30°C	37°C	40°Cb	△GR10-30	△GR37-30
B	3	所有B型菌株	0.026±0.018	0.375±0.027	0.111±0.079	NG	-0.349	-0.264
		BL 90/4	0.010±0.002	0.403±0.047	0.201±0.010	NG	-0.393	-0.202
		BL 93/6	0.046±0.014	0.349±0.106	0.055±0.015	NG	-0.303	-0.294
		Eklund 17	0.022±0.005	0.373±0.092	0.077±0.023	NG	-0.351	-0.296
E	16	所有E型菌株	0.020±0.010	0.355±0.035	0.300±0.083	0.060±0.043	-0.335	-0.055
		K3	0.013±0.006	0.379±0.112	0.387±0.046	0.055±0.057	-0.366	0.008
		K8	0.028±0.000	0.356±0.114	0.188±0.003	0.018±0.009	-0.328	-0.168
		K35	0.014±0.002	0.345±0.041	0.314±0.011	0.028±0.021	-0.331	-0.031
		K36	0.009±0.002	0.358±0.083	0.330±0.057	0.017±0.004	-0.349	-0.028
		K42	0.005±0.000	0.302±0.099	0.217±0.035	NG	-0.297	-0.085
		K44	0.008±0.003	0.390±0.107	0.312±0.050	0.014±0.006	-0.382	-0.078
		K51	0.020±0.004	0.375±0.057	0.194±0.031	NG	-0.355	-0.181
		K101	0.030±0.000	0.336±0.060	0.178±0.049	NG	-0.306	-0.158
		K117	0.033±0.003	0.373±0.100	0.349±0.060	0.086±0.003	-0.340	-0.024
		K119	0.020±0.004	0.345±0.084	0.394±0.034	0.120±0.053	-0.325	0.049
		K125	0.023±0.001	0.330±0.071	0.214±0.063	NG	-0.307	-0.116
		S16	0.039±0.005	0.440±0.135	0.447±0.027	0.093±0.018	-0.401	0.007
		Beluga	0.026±0.002	0.354±0.076	0.284±0.024	NG	-0.328	-0.070
		CB11/1-1	0.015±0.001	0.293±0.055	0.298±0.109	0.060±0.061	-0.278	0.005
		BL 93/8	0.020±0.004	0.365±0.159	0.313±0.111	0.037±0.025	-0.345	-0.052
		31-2570	0.011±0.005	0.335±0.096	0.386±0.032	0.135±0.027	-0.324	0.051
F	5	所有F型菌株	0.021±0.015	0.354±0.045	0.159±0.051	NG	-0.333	-0.195
		BL 86/32	0.006±0.008	0.317±0.083	0.092±0.010	NG	-0.311	-0.225
		BL 86/33	0.030±0.009	0.363±0.080	0.227±0.091	NG	-0.333	-0.136
		BL 86/34	0.041±0.007	0.378±0.090	0.128±0.052	NG	-0.337	-0.250
		610B8-6	0.007±0.008	0.411±0.060	0.177±0.031	NG	-0.404	-0.234
		202	0.021±0.008	0.300±0.098	0.169±0.069	NG	-0.279	-0.131
所有类型	24	所有菌株	0.021±0.012	0.357±0.035	0.247±0.107	0.06±0.05	-0.336	-0.110

a 值为三次重复实验的平均值 b 平均值仅基于在40°C下显示生长的菌株数据计算。NG，未观察到生长。

生长速率与生长温度界限之间的关系。观察到最高生长温度与37°C最大生长速率之间存在高度相关性。仅就B型菌株而言，相关性高于其他菌株。最低生长温度与10°C最大生长速率之间的关联不太明确。

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