3.6.FL保护Δyfh1酵母细胞在稳定期的死亡
与复制寿命相反，酵母寿命的另一个参数是所谓的时序寿命，它由不分裂细胞在进入稳定期后随时间维持活力的能力决定。有充分证据表明，稳定期的存活和时序寿命的延长取决于对多种形式应激抵抗力的发展。因此，我们检查了Δyfh1、WT和FL/Δyfh1在稳定期的细胞存活情况。将三种细胞培养物在稳定期维持如第2节所述。通过用碘化丙啶（PI）染色细胞来测量细胞死亡。
如图6所示，野生型菌株在3天内保持高活力，而frataxin突变体死亡得快得多。PI染色显示，到第1天时Δyfh1的活细胞已少于50%，到第3天时迅速下降至19.6%，而WT到第1天时显示超过80%的活细胞，到第3天时仍有73%的活细胞。有趣的是，frataxin缺陷突变体细胞活力的快速丧失可以通过表达铁蛋白L来部分挽救。用铁蛋白L转化yfh1保护了细胞死亡，使其在第1天达到其WT值的86%，而yfh1仅维持其WT值的59.7%。到第3天，frataxin突变体的细胞死亡率比其WT快2.7倍，而添加铁蛋白将其细胞死亡率减慢至1.45。因此，在Δyfh1酵母细胞中表达人铁蛋白L明显延迟了细胞死亡。
4.讨论
本文提出的工作表明，人铁蛋白L在酵母细胞中的功能与在哺乳动物中相似，结合游离铁从而防止有毒的芬顿反应，表明在单细胞和多细胞真核生物中可能存在防止铁和氧化损伤的共同机制。
4.1.人铁蛋白L通过铁的解毒作用互补frataxin缺陷酵母
众所周知，酵母中不存在铁蛋白。对酿酒酵母的研究表明，酵母蛋白YFH1p可能以类似于铁蛋白的方式在铁储存中发挥作用。已有文献记载，YFH1p的遗传失活导致线粒体铁超载，同时伴随胞质铁浓度低于正常水平。这使我们使用frataxin缺陷酵母作为模型来研究参与铁稳态的人类基因。在本研究中，在yfh1菌株中表达人FL可以至少部分补充frataxin的功能并提高细胞生长速率，表明铁蛋白在防止frataxin缺陷酵母中积累的铁和内源性ROS诱导的损伤方面发挥作用。此外，FL降低了对培养基中供应过量铁的敏感性。FL是一种胞质蛋白，不能进入线粒体。很可能是铁蛋白在胞质中结合游离铁，这导致迁移到线粒体的铁减少，从而减少了通过芬顿反应产生的自由基。胞质铁的减少，例如通过在低铁培养基上生长，也可能防止Δyfh1细胞中线粒体铁的过度积累。
胞质铁短缺会上调FET3，它是质膜高亲和力铁摄取系统的一个组成部分。随之而来的铁摄取速率增加导致细胞铁含量相对于野生型细胞翻倍，但过量的铁异常定位在线粒体中。Δyfh1酵母线粒体中铁的积累也与线粒体铁从线粒体输出到胞质的受损有关。尽管线粒体铁输出到胞质的机制尚不清楚，但已有报道称它需要Fe-S簇的形成。Fe-S簇的输出依赖于位于线粒体内膜中的一种ATP结合盒（ABC）转运蛋白，名为Atm1p。破坏YFH1基因导致Atm1p和Fe-S依赖性酶缺陷，这可能与线粒体铁积累有关。胞质中Fe-S簇的短缺可能会增强铁调节蛋白（IRPs）的IRE结合活性，导致铁蛋白翻译受到抑制。乌头酸是一种参与铁稳态的铁硫蛋白，被发现存在于弗里德赖希共济失调中。还发现酵母乌头酸和胞质Fe-S蛋白异丙基苹果酸异构酶（Leu1）在氨基酸序列上与IRP1具有同源性，并且在酵母中具有IRE结合结构域。人铁蛋白在酵母中的表达是否通过IRPs或Leu1和乌头酸调节仍然是一个悬而未决的问题。
尽管如此，我们在这里的发现表明，铁蛋白L和frataxin可能至少部分共享铁储存和代谢的一般功能。像frataxin一样，人铁蛋白L可能有助于维持酵母以及可能哺乳动物线粒体中的适当铁水平。
4.2.铁蛋白L保护细胞免受氧化应激诱导的损伤或死亡
据报道，Δyfh1突变体线粒体中铁的积累导致高水平的H2O2产生、线粒体DNA丢失和核损伤。后果是对氧化剂的敏感性增加，导致生长速率降低或细胞死亡。非常重要的是，我们报告用人类铁蛋白L互补Δyfh1细胞可以解毒过量的铁和各种氧化剂，并减少蛋白质的羰基化，这两项措施有助于保护细胞免于死亡，从而部分恢复生长速率。
在许多方面，FRDA是涉及线粒体氧化应激和铁的退行性疾病的范例，包括帕金森病和阿尔茨海默病。因此，铁蛋白L在frataxin缺陷酵母模型中的有效性表明，这种方法可能值得扩展到其他疾病，特别是那些与铁代谢相关的疾病，例如造血、炎症、细胞呼吸以及神经和细胞氧化损伤。
4.3.酵母frataxin参与衰老过程
衰老是一个复杂的生物过程，对此提出了许多假设。衰老的氧化损伤理论解释说，衰老效应是细胞中通过各种机制产生的自由基造成的细胞损伤的结果。从氧化损伤理论的角度来看，与较高水平ROS相关的frataxin缺乏预计会缩短寿命。据我们所知，我们首次证明YFH1基因的缺陷会缩短酵母的寿命，并与细胞中蛋白质羰基化增加相关。这一结果也表明YFH1p在控制酵母细胞复制性衰老速率以及时序寿命方面很重要。最重要的是，铁蛋白L抵消了yfh1细胞的快速衰老，并部分恢复了它们的寿命或保护了细胞免于死亡，这与衰老的氧化损伤理论一致。
高活性自由基与各种疾病有关，如心脏病、癌症和白内障。它们也似乎是导致人体结构和功能变化的主要因素之一，这些变化是人类衰老和老年特有的。因此，给实验动物服用抗氧化剂可能会影响它们的寿命。铁蛋白L如何保护细胞免受衰老？我们这里的研究以及来自其他人的证据表明，铁蛋白L作为抗氧化剂在保护细胞免受氧化损伤方面发挥作用。
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