3. 结果
3.1. 外部PASTA结构域对PknB功能很重要
先前已证明，在分枝杆菌中过表达具有酶活性的PknB会导致生长抑制和细菌形状改变。此外，外部PknB_PASTA结构域对于耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌PknB条件突变体的功能互补是不可或缺的。然而，PknB_PASTA结构域在调节分枝杆菌生长和肽聚糖生物合成中的确切作用仍不清楚。在我们最初的实验中，我们研究了过表达pknB的耻垢分枝杆菌的生长模式。
图2.pknB及pknB- DPASTA 过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响。将处于早期稳定期的分枝杆菌（5×10⁶个）接种于含不同培养基的100孔蜂窝板中，置于Bioscreen生长分析仪内，于37℃、888888℃条件下振荡培养5天（含四环素）。数据为两次独立实验中5次重复的平均值。标准差不超过平均值的10%，为清晰起见未予显示。
图3. PknB_PASTA过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响。(a) 舒顿培养基中耻垢分枝杆菌菌株的生长动力学对比。诱导培养组（þtetracycline）与对照组分别使用相同接种量（每孔约2×10⁶个细胞）。(b) 单独过表达非分泌型pasta结构域或跨膜结构域均不影响分枝杆菌生长。(c) 通过蛋白质印迹法检测耻垢分枝杆菌菌株膜组分中PknB_TM-pasta-6 HIS蛋白。(d) 通过蛋白质印迹法检测耻垢分枝杆菌菌株胞质组分中缺失跨膜区的pasta结构域。
将全长pknB或其缺失编码外部PASTA结构域区域的截短形式克隆到含有四环素调节启动子的pMind质粒中。将质粒转化到耻垢分枝杆菌中，所得菌株在没有诱导剂四环素的情况下在所有测试培养基中生长相似。然而，向PknB1或PknB5菌株中添加四环素会影响液体培养基中的生长。这种抑制效应可能是由于pMind质粒诱导表达pknB和pknB-ΔPASTA所致。
当在四环素存在下生长时，PknB1和PknB5以相对较高的水平表达来自pMind的pknB变体；在不存在四环素的情况下，在分枝杆菌中未检测到靶基因的表达。有趣的是，过表达pknB变体导致不同的生长特性。在所有培养基中，PknB1菌株具有更长的表观滞后期和更慢的生长速率，表明过表达缺失外部PASTA结构域的截短PknB的毒性低于过表达全长激酶。
为了进一步直接研究PknB_PASTA结构域在细菌生长中的作用，我们将编码结核分枝杆菌膜锚定外部结构域的pknB区域克隆到pMind质粒中，并将该质粒转化到耻垢分枝杆菌中。在没有四环素的情况下，MIND和TMP菌株生长相似，并且它们的cDNA通过q-RT-PCR分析含有相似水平的tmp转录本。然而，添加四环素导致TMP菌株中tmp转录本的过表达，这导致生长抑制，特别是在Sauton培养基中。TMP菌株需要更长的时间来启动细菌生长，但其生长速率与在MIND对照菌株中观察到的相同。这种表型具有高度可重复性，并且在体外传代后没有改变。
表达没有跨膜结构域的PASTA结构域、单独的跨膜结构域或带有一个PASTA单元的跨膜结构域对细菌生长没有显著影响。过表达具有两个或三个PASTA单元的PASTA结构域的菌株显示出轻微的生长缺陷。所有PASTA变体根据qRT-PCR以相似水平表达。我们生成了TMP和可溶性PASTA结构域的Myc-6xHis标记版本，并通过western blot研究了它们的定位。TMPH在包膜部分中检测到，而PknB14在耻垢分枝杆菌的细胞质中发现。重要的是，TMPH和TMP菌株在本文描述的所有条件下生长没有差异。这些结果证实，只有含有四个PASTA单元的表面暴露结构域显著损害分枝杆菌生长。
PknB_PASTA结构域的过量产生也影响细胞形态。菌株的显微镜检查显示不规则形状的伸长TMP细胞积累，类似于部分缺失PknB的细胞，表明过表达的PASTA结构域可能干扰了PknB功能。此外，万古霉素-BODIPY标记显示新生肽聚糖在TMP分枝杆菌中分布异常。虽然在对照MIND细胞中新合成的肽聚糖主要位于极部和细胞中部，但TMP细胞在整个细胞表面显示出弥散的染色。我们还观察到显著比例的未标记或弱标记的TMP细胞。TMP分枝杆菌倾向于聚集，表明细胞表面改变、细胞分离延迟或裂解增加。
图4。PknB_PASTA过表达导致细菌形态学改变及万古霉素标记变化。对处于对数生长期的分枝杆菌进行万古霉素- BODIPY 偶联物标记，经洗涤后用PBS封片，并使用Diphot300倒置显微镜观察。每株菌株显示三个独立视野。标尺表示5毫米。(a)MIND菌株与(b) TMP 菌株。左图：相差显微镜观察；中图：荧光显微镜观察；右图：合并图像。箭头指示标记肽聚糖。
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