3.结果
3.1.肽设计
我们合成了如表1所示的4到10个残基的线性和头尾环肽。所有肽均获得高纯度，但环七肽c和c未包括在研究内。基于阳离子两亲性基序设计肽，使用Lys作为阳离子残基，Leu和Phe作为疏水性残基。通过改变Lys和Leu的数量制备了不同环大小的环肽。引入谷氨酸残基以促进环状结构的固相合成。使用了三维正交Fmoc/tbutyl/allyl方案。合成开始时是侧链锚定一个适当保护的谷氨酸残基Fmoc-Glu-OAl，从固相支持物上裂解肽后产生Gln。
制备了用D-Phe代替L-Phe的非对映异构体，以研究D-氨基酸掺入对二级结构、抗菌和溶血活性以及蛋白酶稳定性的影响。
我们还制备了环八肽BPC8L的类似物，其中Phe被Leu取代，并进一步研究了该环肽正电荷和疏水性变化对其生物学特性的影响。因此，制备了含有Glu代替Gln、三个Lys或五个Lys的类似物。此外，合成了环化通过谷氨酸残基侧链发生的类似物BPC8S5。
3.2.抗菌和溶血活性
针对革兰氏阴性菌解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌测试了抗菌活性。所有环肽的细菌生长MIC汇编在表1中。
线性序列在高达100μM的浓度下对这些细菌无效。虽然环化并未增强肽序列对解淀粉欧文氏菌的活性，但确实导致对丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌的活性增加，后者是最易感的细菌。
含有偶数个氨基酸的环肽比由奇数个残基组成的环肽表现出更高的活性。通常，含有L-Phe的肽比其D-Phe非对映异构体更具活性，MIC值范围在12.5-100μM和6.25-50μM之间。环十肽BPC10L是最活跃的，在12.5μM时对丁香假单胞菌表现出抗菌活性，在6.25μM时对辣椒斑点病菌有活性。
从具有偶数个残基的环肽组中，BPC4L、BPC8L和BPC10D对辣椒斑点病菌相当活跃，但对丁香假单胞菌的抗菌活性较低。
从包含奇数个残基的环肽组中，环九肽BPC9L对丁香假单胞菌最有效，而非对映异构体BPC9D对辣椒斑点病菌表现出最高的活性。
BPC8L类似物BPC8S1、BPC8S3、BPC8S4和BPC8S5在高达75或100μM的浓度下无活性。在BPC8L中用和Glu分别替换Phe和Gln，产生了一种对丁香假单胞菌活性较低但对辣椒斑点病菌具有相同活性的环肽。
图1-丁香假单胞菌在无BPC4L和BPC4D（A组）及无BPC6L和BPC6D（B组）条件下的生长情况（连续线）。实心符号代表L-构型在含有奇数个残基的环肽组中，环九肽BPC9L对丁香假单胞菌的抑制活性最强（25μM），而其D-非对映异构体BPC9D对斑点病黄单胞菌的活性最高（12.5μM）。在具有偶数残基的环肽组中，BPC4L、BPC8L和BPC10D对斑点病菌（X.vesicatoria）表现出显著活性（12.5μM），但对丁香假单胞菌（P.syringae）的抗菌活性较低（25μM）。我们观察到线性肽测定的tR值低于相应的环状类似物。环肽对HPLC固相疏水表面的亲和力与环大小无关。然而，引入D-苯丙氨酸残基会导致环肽的保留时间略有减少（表1）。结果表明D-氨基酸的引入能够100μM浓度下的非对映异构体（◆）、75μM浓度（▲）及50μM浓度（■）；空心符号分别对应100μM浓度（○）、75μM浓度（△）和50μM浓度（□）下的D型非对映异构体。
还测试了最具活性的环肽对高度敏感的人红细胞的溶血活性。以360μM时肽的溶血百分比表示的结果表明，溶血活性取决于环的大小。环越大，溶血活性越高。因此，环四肽BPC4L和BPC4D溶血性最低，而环十肽BPC10L和BPC10D溶血性最高。结果还表明，所有D-非对映异构体对红细胞的活性均低于L-类似物。BPC8S1、BPC8S2和BPC8S3的溶血活性明显低于母体序列BPC8L。
3.3.杀菌活性分析
我们通过比较杀死丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌的中期对数期培养物悬浮液的时间过程，评估了BPC6L、BPC6D、BPC10L和BPC10D的杀菌活性。如图所示，在测试浓度下，所有肽对丁香假单胞菌的杀菌作用均比对辣椒斑点病菌慢。L-非对映异构体在两种病原体中均表现出比其D-对应物更高的杀菌活性。肽在开始细菌细胞杀灭的时间和存活动力学斜率方面表现出差异。除BPC10L显示出相同的动力学外，根据目标病原体的不同，效果也不同。
图2-在选定环肽存在下丁香假单胞菌（P.syringae）和斑点病菌（X.vesicatoria）的存活动力学。细菌悬液分别进行未处理（■）或使用60μM BPC6L（◆）、BPC6D（◆）、BPC10L（●）和BPC10D（○）处理，并在不同时间间隔测定活细胞数。
3.4.反相高效液相色谱分析
通过RP-HPLC测定肽的疏水性，以阐明其对抗菌活性的影响。RP-HPLC用作给定分子形成疏水结构域能力的量度，以及用于排序和比较肽两亲性的方法。RP-HPLC保留时间的增加与肽两亲性的增加相关。
我们观察到，线性肽测定的保留时间值低于相应的环状类似物。环肽对HPLC固相疏水表面的亲和力与环大小无关。然而，引入D-Phe残基导致环肽的保留时间略有减少。结果指出，D-氨基酸掺入提供了相对于L-非对映异构体具有较低两亲性的环肽。
3.5.对蛋白酶降解的敏感性
为了比较环状和线性肽对蛋白酶降解的敏感性以及D-氨基酸掺入的影响，将环十肽BPC10L、BPC10D及其线性对应物暴露于蛋白酶K。通过RP-HPLC随时间监测降解情况。环肽BPC10L比线性类似物更稳定；孵育60分钟后，BPC10L仅发生50%降解，而线性衍生物完全降解。引入D-Phe残基提供了具有更高稳定性的肽，孵育60分钟后，BPC10D及其线性类似物均未观察到降解。
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