使用MALDI-TOF鉴定分离株
使用MALDI-TOF Biotyper鉴定了49株细菌分离株。植物乳杆菌NRRL B-4496用作参考菌株。孵育24小时后，将单个菌落转移到装有150μl无菌去离子水的Eppendorf管中。通过反复移液和涡旋使样品均质化。向Eppendorf中加入450μl纯乙醇，并通过涡旋混合内容物至少1分钟。在13000 rpm下离心2分钟后，弃去上清液；重复此步骤两次。加入40μl的70%甲酸溶液并涡旋，并加入等体积的99%乙腈。涡旋1分钟后，将样品离心（2分钟，13,000 rpm）。将1μl上清液一式三份点样到金属板上。在室温下干燥后，用1μl基质（浓度为10 mg HCCA-α-氰基-4-羟基肉桂酸/ml）覆盖斑点并干燥。将板引入带有1000 Hz掺钕钇铝石榴石氮激光器（Nd-YAG）的UltrafleXtreme MALDI TOF质谱仪中。使用MALDI Biotyper 3.0软件包自动分析样品。鉴定概率以0到3.0的分数表示。结果高于2.0表示属鉴定可靠且种鉴定可能。根据高鉴定概率选择了九个分离株用于本文的进一步实验。
16S rRNA基因测序和种特异性PCR
使用Genomic Mini AX Bacteria Spin对九个菌株进行DNA提取。对于16S rRNA基因的扩增，使用了通用引物(27f)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和(1495r)5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR反应在总体积为20μl的体系中进行，使用PCR Master Mix(2x)，在Labcycler中进行。扩增反应在30个重复循环中具有以下步骤：变性95°C 1分钟，退火48°C 30秒，延伸72°C 2分钟，最终延伸72°C 10分钟，并将样品冷却至4°C。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离。核苷酸序列通过BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒和毛细管测序系统3730x1 DNA分析仪确定。序列通过DNA Baser Assembler组装，随后与BLAST比对，并在NCBI GenBank中比较以找到最近的亲属。使用MEGA 4基于16S rRNA序列构建邻接树进行系统发育分析。由于比对后没有分化，仅使用一个代表性序列来创建图表。用于构建系统发育树的16S rRNA基因序列长度约为1450个碱基对。
此外，使用了检测recA基因系统发育标记的多重PCR；这揭示了植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和副植物乳杆菌之间的区别。多重PCR使用四种引物进行：paraF(59-GTC ACA GGC ATT ACG AAA AC-39)、pentF(59-CAG TGG CGC GGT TGA TAT C-39)、planF(59-CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA-39)和pREV(59-TCG GGA TTA CCA AAC ATC AC-39)。反应组成为13μl PCR Master Mix(2x)，每种引物0.75μl，以及10.5μl无核酸酶水；反应条件如前所述。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离。为了阐明嗜果糖特性，进行了adhE基因的PCR反应；反应条件如前所述。
生化特性
使用Hi-Carbo Kit测定碳水化合物发酵。将浊度为0.5 OD nm（600 nm）的接种物添加到含有35种糖的孔中，并在37°C下孵育24和48小时。对于碳水化合物利用，另外使用了参考菌株植物乳杆菌NRRL B-4496。通过杜兰管试验读取葡萄糖产气情况，并通过与3%（v/v）H2O2反应测定过氧化氢酶活性。使用API ZYM测定酶产生模式。将浊度为0.8 OD nm（600 nm）的接种物添加到20个板中，并在37°C下孵育4小时。
生物活性
分离株的嗜果糖特性
使用Bioscreen C系统测定嗜果糖特性。孵育24小时后，将细菌培养物离心并从培养基中去除。将细菌细胞悬浮在生理盐水中，并在600 nm处设定相同的0.5光密度。将分析的细菌在含有10 g(L-1)D-果糖的FYP、含有10 g(L-1)D-葡萄糖的GYP、含有5 g(L-1)D-葡萄糖和5 g(L-1)丙酮酸作为外部电子受体的GYP-P，以及含有300 g(L-1)D-果糖、300 g(L-1)D-葡萄糖、400 g(L-1)D-葡萄糖和500 g(L-1)D-葡萄糖的MRS中生长。
将350μl培养基一式三份转移到100孔蜂窝板中，并用50μl细菌悬浮液接种孔。实验在有氧和厌氧条件下进行，每2小时测量一次OD600nm，持续48小时。通过滴加几滴石蜡切断氧气供应来获得厌氧条件。根据生长特性，选择了九个菌株进行进一步检查。使用PYTHON脚本根据Hoefflinger等人确定生长曲线参数（最大比生长速率、延滞时间、倍增时间等）。通过在探针中观察到大量生物质来测试高糖耐受性，使用富含20、30、40和45%（w/v）果糖和葡萄糖的FYP和MRS肉汤或含有5%NaCl（w/v）的肉汤。通过在含有10 g(L-1)CaCO3的FYP-琼脂和MRS-琼脂上孵育并利用带有UV-Vis检测器的HPLC确认来检查乳酸的产生。在旋转摇床中通气（150 rpm）培养3天后测定糖的产生。使用红外检测器测定孵育3天后消耗的葡萄糖和果糖量。在所有测试中均使用参考菌株植物乳杆菌NRRL B-4496作为对照。
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