2.3. 费氏弧菌的生长曲线测试
采用96孔微孔板法测定费氏弧菌的生长曲线。该测定使用白色不透明96孔微孔板测定生物发光曲线，使用透明96孔微孔板测定细菌生长曲线。将细菌（T3突变体）从琼脂斜面接种到液体培养基中。生物发光和光密度分别在20°C下，使用Luminoskan Ascent Thermo Scientific化学发光分析仪和Bioscreen C MBC自动生长曲线分析仪每0小时测定一次，持续24小时。
2.4. 时间依赖性毒性测试
通过96孔微孔板法进行QSI和六种SAs的时间依赖性毒性测试。化学品浓度系列在板上以三重复分布。每孔含有80μL化合物或2%氯化钠溶液（作为对照）、80μL培养基和40μL制备好的费氏弧菌。使用Luminoskan Ascent Thermo Scientific化学发光分析仪在20°C下，每隔1小时测定费氏弧菌的相对发光单位，持续24小时。毒性结果以抑制率表示如下：
抑制率 = (RLU0 - RLU) / RLU0 × 100%
其中，RLU0是费氏弧菌暴露于对照的平均RLU值，RLU指暴露于测试化学品的平均RLU值（三次实验）。
在研究单一化学品的24小时毒性后，基于RLU的抑制率，使用概率单位模型计算中位效应浓度。根据EC50，获得了具有等毒比（相同的EC50值）的QSI和六种SAs的一系列二元混合物。测试采用与个体毒性测试相同的方法进行。
2.5. 同源建模和分子对接
使用Discovery Studio 3.1中的MODELER对LuxR进行同源建模。来自费氏弧菌的AAQ90196被选为本研究的目标LuxR蛋白。通过使用DS中实现的BLAST模块扫描NCBI的蛋白质数据库来准备模板。详细信息见支持信息。
分子对接基于DS，使用默认参数的CDOCKER协议进行。分子对接中使用的化学品（配体）的三维结构用Chemoffice生成，对接前使用CHARMm力场对配体进行能量最小化。基于CDOCKER，选择给出最低相互作用能的底物方向进行对接后分析，并利用产生最低对接能量的结合情况进行进一步分析。
二氢蝶酸合酶（Dhps）的建模和对接研究采用类似方法进行。选择TP-203863作为目标序列，1AJ0作为Dhps建模的模板。更详细的信息见支持信息。
3. 结果与讨论
3.1. 费氏弧菌的生长曲线
图2 蓝线和红线分别表示费氏弧菌在24小时内的生物发光（HV）和生长（OD）曲线。
如图2所示，费氏弧菌（HV）的生物发光在0到10小时之间较弱，在17小时迅速增加到峰值，然后逐渐下降。上述行为密度依赖于并受群体感应系统控制。费氏弧菌的生长曲线（OD）显示在延迟期（0-8小时）细菌密度较低，在此期间细胞产生并释放低浓度的N-(3-氧代己酰)高丝氨酸内酯信号分子（C6）以及LuxR蛋白。在6小时，N-辛酰HSL信号分子（C8）正在增加；这些分子可以与AinR结合，通过增加LuxR蛋白的量来加速细菌的生长。因此，C8有机会与LuxR结合，促进luxICDABEG的表达。图2中的插图显示，8小时后细菌生长进入指数期，细菌密度急剧上升，C6和LuxR增加，导致发光强度迅速增加。发光从17小时到24小时的下降表明C6开始减少，尽管C8的浓度仍然很高，因为细菌数量在稳定期缓慢增加。
3.2. SAs对费氏弧菌的时间依赖性毒物兴奋效应
测定了SAs对费氏弧菌在24小时内每小时的毒性效应，SM的时间依赖性结果见附录图4。简而言之，图3(A)显示了SM在0、4、10、18和24小时对费氏弧菌的毒物兴奋效应。在0到3小时间，没有观察到对生物发光的刺激或抑制，因为当培养条件改变时，细菌的生长受到许多影响因素的抑制。作为因素之一，外源化学品对费氏弧菌的生物发光影响轻微。
图3. SM、B3O及其混合物对费氏弧菌（V. fischeri）在0、4、10、18及24小时内的毒性作用。(A) SM；(B) B3O；(C) SM与B3O联用。
当暴露时间从4小时增加到8小时时，在附录图4中仅能观察到刺激作用，并且这种刺激与SM的浓度具有剂量-反应关系。此时，细菌中LuxR蛋白的背景浓度较低，如第3.1节所示。因此，发光强度的增加表明SM可能刺激了LuxR的表达。
图4. PABA(A)与SM(B)与Dhps对接过程中的配体相互作用示意图。蓝色虚线与黄色实线分别表示配体与氨基酸残基之间的氢键及π-阳离子键。
从9到17小时，虽然浓度在1.07x10⁻⁵ 到 1.71x10⁻⁵ mol/L（LogC值在-4.97到-4.77之间）的SM刺激生物发光，但当SM浓度增加到1.92x10⁻⁵ 到 8.5x10⁻⁵ mol/L（LogC：在-4.72到-4.07之间）时，则产生抑制效应。此时期是细菌的指数期，细胞产生大量LuxR蛋白，这可能掩盖了SM对LuxR表达的刺激作用。分子对接可用于解释此期间高浓度SM的抑制效应。PABA和SM在Dhps结合位点的对接视图如图4所示，该图显示PABA通过两个氢键与Dhps蛋白的ARG-63和ARG-220残基结合，并通过pi-阳离子相互作用与LYS-221残基结合（图4A）。对于SM（图4B），虽然SM和Dhps的ASP-96之间只形成一个氢键，但SM和Dhps之间形成了三个pi-阳离子键，这表明Dhps-SM复合物比Dhps-PABA复合物更稳定。因此，SM可以与PABA竞争结合Dhps，从而停止对细菌生长至关重要的二氢叶酸的合成。因此，高浓度的SM抑制了费氏弧菌的发光。
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