摘要
在不同环境条件下（pH 4.5至7，NaCl浓度0.5%至8%，温度30°C），测定了接种单细胞无害李斯特菌的孔中达到浊度的时间分布。通过统计分析确定，检测时间T变异的主要来源是个体滞后时间的变异性。观察到检测时间与其标准偏差之间存在线性关系dev(T)∝T。在生长缓慢时，其他变异来源变得越来越显著。
1. 引言
浊度测量被用作估计细菌生长参数的替代方法，以取代传统的平板计数法。随着预测微生物学新趋势开始关注细菌对食品环境响应变异性的量化，浊度测量的使用日益增加。这在微生物风险评估研究中尤为重要。自动化浊度测量系统能够产生大量重复观测数据，这对方差分析计算至关重要。
浊度是入射光强度与培养物散射光强度的比值。在较高细胞密度（10^6.0至10^7.5 CFU/ml之间）时，它遵循比尔定律，即浊度与细胞浓度成正比。比例范围取决于细菌的大小和形状，而这些又可能受环境条件的影响。例如，在乳酸存在下，单核细胞增生李斯特菌的线性范围非常窄。细胞浓度与浊度之间的相关性（也称为校准）取决于细菌种类，有时甚至取决于所使用的特定菌株。由于浊度与细胞浓度之间存在可接受关系的范围有限，生长参数的估计往往不够准确。
一些作者将光密度（OD）曲线的参数直接与"真实"（活菌计数）比生长速率和滞后时间联系起来。他们将生长曲线拟合到OD值，并通过校准用这些曲线来描述细胞浓度的增加。在大多数条件下，结果相当好，但并非所有条件都如此。作为替代方案，其他作者提出使用观测到的检测时间，即细胞群体达到可检测浊度水平的时间，而不是整个浊度生长曲线。当将检测时间与初始细胞浓度作图时，应该得到一条直线，其斜率与比生长速率成反比。本研究使用该技术研究了单个细胞群体滞后时间的群内方差。
传统上，滞后时间是在"log(细胞浓度) vs. 时间"曲线上定义的。滞后期的结束是生长曲线指数阶段的切线与接种水平交叉的时间点。Baranyi和Roberts提出了一个更具机制性的定义。引入了初始生理状态参数（a₀），并将滞后时间计算为a₀和随后比生长速率的函数。
单个细胞的滞后时间与群体滞后时间之间的联系并不直接。Baranyi和Baranyi与Pin对此进行了分析，并推导出一个数学公式，将个体滞后时间的分布与整个群体的滞后时间联系起来。该公式意味着，单个滞后时间的平均值可能比群体水平观察到的滞后时间长得多，尽管单个生理状态参数的平均值与群体的生理状态参数相同。此外，从滞后期到指数期的过渡曲线可以通过个体滞后时间分布的变换获得，但根据现有数据的当前精度，无法从群体生长曲线推导出个体滞后时间的分布。因此，单个细胞的滞后时间不能使用传统活菌计数进行研究。自动化浊度测量可以提供解决方案，因为它们适合产生大量重复的检测时间测量。如果每个观测到的培养物都从一个单细胞开始，那么检测时间的分布应该接近初始单个细胞滞后时间的分布，假设由单细胞产生的每个群体的比生长速率相同且恒定。
本文中，无害李斯特菌的个体滞后时间是通过单细胞产生的亚群体产生的浊度检测时间确定的。细胞经受不同的pH和NaCl浓度，并通过统计分析这些环境因素对获得分布的影响。
2. 材料与方法
2.1. 实验
2.1.1. 菌株
无害李斯特菌被用作测试生物，因为它处理安全，但具有与食品致病菌单核细胞增生李斯特菌相似的性质，后者是食品工业中的主要关注点。无害李斯特菌，菌株NCTC 11288，血清型6a，保存在胰蛋白胨大豆琼脂斜面（TSA，Oxoid）上，储存于3°C。
2.1.2. 生长曲线
将无害李斯特菌从储存斜面接种到胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在30°C下培养24小时。将培养物用蛋白胨盐稀释液（PSDF）稀释1:1000，取50μl接种到50ml测试培养基中。这是补充了1%葡萄糖和0.3%酵母提取物的TSB（TSYGB，Oxoid）。用1M HCl将pH调节至7.0、5.5、5.0和4.5。向pH 7.0肉汤中添加NaCl，使最终浓度达到4%、6%和8%。
肉汤在30°C水浴中培养，立即取样并在长达72小时的时间间隔内取样。样品在PSDF中稀释并涂布到三份TSA平板上进行活菌计数。
2.1.3. 生长实验
实验的目的是使许多单独的介质体积接种平均一到两个细胞。
将无害李斯特菌从储存斜面接种到TSB中，在30°C下培养至稳定期24小时。将培养物在PSDF中稀释至20个细胞/ml。将稀释后的培养物接种到两个一百孔板的孔中（每孔50μl）。然后每孔加入350μl测试培养基（TSYGB pH 7.0，添加或不添加NaCl；或pH 5.5、5.0、4.5，不添加NaCl）。将装满的板放入Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪（Labsystems）中，在30°C下培养。在长达7天的时间内，以600nm波长定期监测浊度。
为了估计每孔接种的细胞数量，将接种培养物的稀释液涂布到TSA平板上，在30°C下培养2天。
每种环境条件下的实验重复两到三次。
2.1.4. 检测时间
检测时间是孔达到0.11浊度所需的时间。这对应于10^7个细胞/ml的浓度，并通过每种环境条件下的活菌计数进行验证。
2.1.5. 读数精度
通过在与生长实验相同的条件下进行实验来检查Bioscreen读数的精度，但使用10^7个细胞/ml代替20个。在最佳条件下，大群体的滞后期应该是恒定的，因此孔之间的变异性就是Bioscreen读数的变异性。
2.2. 理论
假设一个孔接种了N₀个细胞，在滞后期后，细菌群体以恒定的比生长速率μ生长，在时间T_det达到检测水平N_det，此时培养物仍处于指数期。那么检测时间T_det可以通过以下公式计算：
其中λ(N₀)表示具有N₀个细胞的孔中培养物的滞后时间。当N₀=1时，个体滞后时间的分布应该反映在检测时间的分布中（图1）。然而，通过连续稀释获得的每孔细胞数N₀不一定恰好为1，N₀的变异性对观测到的T_det值的变异性有贡献。在分析检测时间中观测到的变异性来源时，我们可以安全地假设：
图1. 对于由单个细胞生成的亚群（N0 = 1），在假设相同生长速率的情况下，检测时间的分布与单个细胞滞后期的分布完全一致。
比生长速率在群体中是均匀的，并且在初始细胞的第一次分裂后保持恒定；
N₀，即每孔的初始细胞数，遵循泊松分布。
我们实验验证了：
检测水平对应于相同细胞密度，无论研究的条件如何。
Bioscreen的OD测量不准确性（噪声）不显著。
在相同的生长条件下，检测时间值是可重复的。
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