研究简介
噬菌体和转座元件加速有利性状在细菌群体中的传播，促进基因组多样性和进化。院内肺病原体肺炎军团菌表现出极高的基因组可塑性。本研究首次报道嗜肺军团菌携带一种65 kb的整合接合元件ICE-βox。该元件可在菌株间自主转移并位点特异性整合，赋予宿主对β-内酰胺类抗生素、过氧化氢及含氯漂白剂的氧化应激抗性。表型芯片、生长曲线及杀菌实验一致显示，含ICE-βox的供体与接合子存活率显著高于无元件受体。在巨噬细胞感染模型中，ICE-βox使军团菌在限制性C57BL/6细胞内存活提高约10倍。通过表型微阵列和生长曲线分析，研究人员发现ICE-βox显著提升了嗜肺军团菌对β-内酰胺类抗生素（如奥沙西林和青霉素）、过氧化氢以及含氯消毒剂（漂白水）的耐受性。
这种保护作用源于ICE-βox可能携带的抗氧化酶基因，如肽甲硫氨酸亚砜还原酶（msrAB）和烷基过氧化氢还原酶（ahpCD），它们帮助细菌中和活性氧物质（ROS）造成的损伤。若宿主NADPH氧化酶缺失，该优势消失，证实其保护作用依赖吞噬细胞氧化爆发。元件携带38个货物基因，含两套甲硫氨酸亚砜还原酶(msrAB)及烷基过氧化氢还原酶(ahp)等抗氧化酶，可强化细菌清除活性氧能力。研究还发现，临床常用消毒剂浓度不足以杀灭含ICE-βox菌株，提示该元件既促进军团菌在工程水系统中耐受消毒，又增强其对宿主先天免疫的抵抗力，可能推动高毒力菌株的出现与传播。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
将含或不含ICE-βox的菌株培养至指数期后，分别加入100µg/ml苯唑西林、2µg/ml青霉素G或0.5 ppm漂白剂，立即分装到Bioscreen专用蜂巢板，每孔300µl，37°C中强度振荡，每小时记录OD600，持续60 h。Bioscreen仪器连续读取光密度，自动生成生长曲线，作者用t检验比较同一时间点不同菌株的OD值，从而量化ICE-βox赋予的耐受幅度。研究人员用Bioscreen连续监测0.5 ppm有效氯下的细菌增殖，证实含元件菌株12 h内OD上升3倍，而无元件株几乎无增长，直接支持“ICE-βox帮助军团菌在常规漂白剂浓度下存活”的结论。
实验结果
研究证实，ICE-βox是一个约65 kb的整合性接合元件，能够通过细菌接合作用自主转移，并位点特异性整合到受体菌的染色体中。该元件包含38个“货物基因”、4个调控基因以及18个编码IV型分泌系统的基因。实验表明，ICE-βox在指数生长期的转移效率显著高于稳定期，且其剪切和整合过程不依赖于外部氧化应激的诱导。在细胞感染模型中，ICE-βox显著增强了嗜肺军团菌在多种小鼠巨噬细胞内的存活和复制能力。特别是在具有功能性NADPH氧化酶的巨噬细胞（如C57BL/6来源的巨噬细胞及J774野生型细胞）中，ICE-βox的存在使细菌存活率提高约10倍；而在NADPH氧化酶缺陷的巨噬细胞中，含与不含ICE-βox的菌株生长差异消失，证明其保护作用依赖于对抗宿主氧化爆发的能力。
图1、ICE-ox是可移动遗传元件。(A)ICE-ox示意图。65 kb基因座预测包含38个货物基因（实心箭头）、4个调控基因（灰色箭头）、18个IV型分泌系统（T4SS；条纹箭头）基因。ICE-ox两侧为43 bp直接重复序列，推测作为整合位点（attL和attR）。示意图非按比例绘制。(B)E期和PE期细胞介导的ICE-ox转移对DNase I耐受。在选择性培养基上接种可鉴定质粒或ICE-ox转受体。共轭效率（平均±SEM）为每个供体细胞对应的ICE-ox阳性JR32受体细胞数。E期供体的共轭效率显著高于PE期，Student t检验，**P<0.01。(C)ICE-ox切除实验示意。引物组P1/P2和P3/P4分别扩增attL和attR连接片段，P2/P3扩增切除的ICE-ox产物（attI），P1/P4扩增切除后染色体残留的结合位点（att）。(D)PCR检测环化ICE-ox。利用A板描述的PCR方法，用Lp02供体（MB1353）、受体（JR32,MB1354）和转受体（JR32+ICE-ox,MB1354）的基因组DNA，检测整合（attL和attR）和切除（attI）形式的连接片段，以及切除后残留位点（att）。
图2、ICE-ox促进氧化应激下生存。(AB)ICE-ox增强对氧氯西林和青霉素耐受。E期ICE-ox供体（D，圆圈）、受体（R，方块）、转受体（T，三角）暴露于100μg/ml氧氯西林（A）或2μg/ml青霉素G（B），用Bioscreen生长曲线分析仪测定OD600。(C)ICE-ox增强对氧氯西林、青霉素和H2O2的耐受性。E期细胞暴露6小时后，计算（CFU处理/CFU未处理）平均±SEM。(D)ICE-ox提高对漂白剂耐受性。E期菌株在0.5 ppm漂白剂中培养，用Bioscreen测定OD600。
图3、ICE-ox在耐受巨噬细胞中提供保护。(A)ICE-ox提高A/J巨噬细胞中适应性。MOI=1感染，计算平均CFU±SEM，三重复样本，代表三次独立实验。t检验显示ICE-ox携带与否差异显著（****P<0.001）。(B)ICE-ox提高激活A/J巨噬细胞中细菌持续性。用100 U IFN-γ激活巨噬细胞，MOI=1感染。显示CFU相对2小时的倍数变化（平均±SEM）。t检验显示差异显著（***P<0.005）。(C)ICE-ox提高C57BL/6（BL/6）巨噬细胞中持续性。骨髓衍生巨噬细胞感染后计算CFU±SEM，t检验显示差异显著（***P<0.005）。(D、E)ICE-ox保护细菌免受BL/6巨噬细胞降解。24小时后，用L.pneumophila特异性抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色观察。显示含降解细菌巨噬细胞百分比±SEM，t检验差异显著（**P<0.01）。(F、G)ICE-ox保护作用依赖NADPH氧化酶。WT（F）或NADPH氧化酶缺失（G）J774细胞MOI=1感染，计算平均CFU±SEM，t检验显示WT巨噬细胞中差异显著。
图4、控制增长曲线实验。（A）在标准培养基中，ICE-βox不影响应变生长。在所有生长曲线实验中，AYE的生长被用作菌株存活能力的对照。供体（D）、转结合株（T）和受体株（R）在标准AYE汤中以三倍培养，OD600在生物筛生长曲线分析仪显示的时间点被记录。图中显示±从一个实验中三次重复计算出的SEM平均值，代表了另外三个实验。t检验显示含有或缺乏ICE-βox的菌株间差异具有统计学显著性（****，P<0.001）。（B）ICE-βox独立于氯霉素盒保护菌株免受霉素胁迫。已清除氯安素抗性标记的供体（Cured D，MB1357）和转接株（Cured T，MB1358）和受体（R）株暴露于25μg/ml，并在所示时间内，其生长通过生物筛生长曲线分析仪在600 nm处以光学密度量化。图中显示±从一个实验中三倍样本计算出的SEM平均值，代表了另外三个实验。
图5、ICE-βox切除不与生长阶段同步。（A和B）qPCR分析表明，ICE-βox切除与生长期不协调。为确定切除频率，检测方法是定量使用从L、指数（E）、晚指数（LE）或后指数（PE）培养的L.pneumophila Philadelphia-1菌株中分离的DNA。切除通过PCR定量，使用针对ICE-lvh（A）或ICE-βox（B）特异的引物组。通过阈限循环（ΔΔCT）方法比较切除ICE与整合ICE的丰度，并对染色体基因rpoS进行归一化。以下为三个独立实验±SEM的平均值。
总结
本研究确认了ICE-βox是嗜肺军团菌首个可水平转移、赋予氧化应激抗性的整合接合元件。该元件通过携带msrAB、ahp等抗氧化基因，使宿主在β-内酰胺抗生素、过氧化氢及饮用水平漂白剂浓度下存活率显著提高；在巨噬细胞内，其保护作用完全依赖宿主NADPH氧化酶，表明ICE-βox专门抵御吞噬细胞氧化爆发。由于ICE-βox可高效转移且八株测序菌均保留其整合位点，该元件具备在军团菌种内扩散的潜力，既增强病原体在消毒水系统中的适应力，也提升其对人宿主先天免疫的抵抗，可能促进高毒力、耐消毒菌株的涌现，对公共卫生防控构成新威胁。
首次报道了ICE通过传递氧化应激抗性直接增强病原体毒力。由于ICE-βox的整合位点（att位点）在嗜肺军团菌各菌株中高度保守，该元件有望在种群中快速传播。这不仅可能提高细菌在经氯消毒的供水系统等工程环境中的存活率，还增加了其传播至人类宿主并引起疾病的风险。因此ICE-βox的研究对于理解医院内感染控制及病原体进化具有重要意义。Bioscreen在本研究中承担了“高通量、实时、定量”记录细菌在抗生素和氧化消毒剂胁迫下增殖能力的任务，提供了时间分辨的生长动力学数据，使作者得以用统计显著性评价ICE-βox的表型优势，是论文体外抗性证据的关键技术支撑。
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