发酵培养基和培养条件
微生物培养在250 mL锥形瓶中进行，培养基体积为50 mL，温度为30-45{}^{circ}C，摇床转速170 rpm，培养4-15天。在550 nm波长下吸光度为0.2的营养肉汤培养物（葡萄糖1%，营养肉汤0.8%）用作接种物，每瓶使用1 mL。研究中使用的基础培养基组成（%）：MgSO₄0.1，KH₂PO₄0.01，CaCl₂0.01，FeSO₄·7H₂O 0.001，补充有酵母提取物0.05，可选择性地去除或替换为蛋白胨或葡萄糖/氯化铵。基本的碳源和氮源是完整的、脱脂的白鸡羽毛（1-6%）或其他角蛋白材料（1%）。培养基调至pH 7.2，并在121°C下高压灭菌20分钟。
为了确定还原剂对角蛋白酶生产和羽毛降解的影响，使用含有酵母提取物0.05%和鸡羽毛1%的基础培养基，并补充1 mM的亚硫酸钠、二硫苏糖醇或半胱氨酸。
还原剂对细胞生长的影响在Bioscreen C 微生物生长曲线分析仪（Labsystems）中测试，使用0.3 mL营养肉汤，补充有0.5或1 mM的亚硫酸钠、二硫苏糖醇、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或2-巯基乙醇。从获得的生长曲线计算延滞期持续时间（lag）、最大比生长速率（μmax）和最大生物量（ODmax）。
酶学测定
所有测定均在收集的培养液中进行，先通过Whatman 2号滤纸过滤去除羽毛碎片，然后在4°C下以10，000 g离心10分钟。为了测定二硫键还原酶活性，也收集了细胞沉淀。
对可溶性角蛋白的角蛋白分解活性测定混合物包含：角蛋白溶液2 mg/mL（0.5 mL），Tris-HCl缓冲液0.05 M，pH 9.4（0.48 mL），培养液（0.02 mL），并在55°C下孵育15分钟。反应通过加入1 mL 8%三氯乙酸（TCA）终止。混合物冷却30分钟，以10，000 g离心10分钟，并在280 nm波长下测量吸光度。一个单位的角蛋白分解活性（KU）定义为在1分钟内，每1 mL酶引起的TCA可溶性产物吸光度增加0.01。可溶性角蛋白根据Wawrzkiewicz等人的方法制备，通过将羽毛溶解在沸腾的DMSO中并用丙酮（比例1:3）沉淀。
蛋白水解活性的测定如上所述，使用2%酪蛋白溶液作为底物，在45°C，pH 8.6下进行反应。一个单位的蛋白水解活性（PU）代表在1分钟内，每1 mL酶引起的吸光度增加0.01。
对天然鸡羽毛的角蛋白分解活性测定混合物包含：精细切碎的羽毛100 mg，Tris-HCl缓冲液0.05 M，pH 9.4，含CaCl₂5 mM和叠氮化钠0.02%（8 mL）以及培养液（2 mL），在55°C下孵育4小时。可选择性地加入最终浓度为1 mM的还原化合物：半胱氨酸、亚硫酸钠或二硫苏糖醇。反应通过加入10 mL 8%TCA终止。混合物冷却30分钟，通过Whatman 2号滤纸过滤，并以10，000 g离心10分钟。在280 nm波长下测量吸光度。一个单位的角蛋白分解活性（KU/h）定义为在1小时内，每1 mL酶引起的TCA可溶性产物吸光度增加0.01。
谷胱甘肽还原酶活性根据Carlberg和Mannervik的方法测定，在氧化型谷胱甘肽存在下，在NADPH存在下，于30°C在Tris-HCl缓冲液0.05 M，pH 7.0中进行反应。来自第四天培养的上清液，以及细胞匀浆或其离心后的上清液用作酶源。细胞匀浆通过将缓冲液洗涤并冷却的细胞悬浮液超声处理2分钟（循环0.5秒开/0.5秒关）获得。活性表示为在1分钟内，由1 mL（培养液部分）培养液或1 g干生物量（细胞匀浆部分）氧化的NADPH的微摩尔数。
分析测定
硫化合物根据以下方法测定：还原性硫醇-使用5，5'-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）的Ellman方法；硫酸盐-涉及氯化钡的Kolmert等人的方法；亚硫酸盐-Kletzin描述的使用品红和甲醛的方法；硫代硫酸盐-Sorbo的使用氰化钾的方法。
培养液中的蛋白质浓度根据Lowry的方法使用Folin-Ciocalteu试剂测定，游离氨基酸使用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）根据Snyder和Sobocinski的方法测定。
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