2.3.茶多酚
使用中性pH条件下的云南普洱茶乙酸乙酯/水多酚提取物。纯酚类和芳香化合物，包括表儿茶素、儿茶素、3,4,5-三羟基苯甲酸（没食子酸）、3,4-二羟基肉桂酸（咖啡酸）、3-（4-羟基苯基）丙酸、3-苯基丙酸和4-羟基苯乙酸购自Sigma-Aldrich，而3-氧-甲基没食子酸购自extrasynthese。
2.4.肠道细菌培养
将培养基和添加了0.1%（w/v）芳香化合物的培养基接种5%（v/v）的细菌培养物，并分别在37°C有氧和厌氧条件下培养。按传统方式冲泡的浓云南普洱茶中芳香化合物的浓度估计约为0.1%（w/v）。在添加酚类后的0小时和24小时对细菌上清液进行取样。在13600 g离心10分钟后收集细菌细胞沉淀，并洗涤以去除从上清液中携带的任何痕量酚类。在初步研究中证实了彻底的洗涤程序，其中对照沉淀物接种了标准酚类混合物。
2.4.1.酚类和芳香化合物的提取
将100微升上清液用浓盐酸酸化（最终盐酸浓度为2%，v/v），并在提取前加入5纳摩尔内标。将细胞沉淀进行超声处理以裂解细胞，释放吸附在细菌上或进入细菌的任何酚类。细胞裂解液离心后按上述方法处理。将酸化的样品上样到含有硅藻土的固相萃取柱上，随后使用1.8毫升乙酸乙酯洗脱。
2.4.2.衍生化
所有样品的衍生化均按先前描述进行。基本上，向样品中加入10微升甲硅烷基化级乙腈，然后加入50微升含1%三甲基氯硅烷的双（三甲基硅基）三氟乙酰胺。在室温下孵育3小时允许酚类物质完全衍生化。
2.4.3.气相色谱-质谱联用分析
通过各种细菌产生的酚类代谢物的分析通过GC-MS进行。将衍生化样品通过连接有Hewlett Packard 5890II气相色谱仪的Hewlett Packard 5973质谱检测器进行分析，配备自动进样器和计算机工作站。进样口、MS离子源和GCMS接口温度分别保持在280°C、230°C和290°C。分离在熔融石英毛细管柱上进行，该柱涂有交联的5%苯基甲基聚硅氧烷。
氦气为载气，流速为1毫升/分钟。将1微升衍生化样品以8:1的分流比注入GC进样口。柱温在100°C保持1.5分钟后，以10°C/分钟的速度升至140°C，然后在140°C保持2分钟，再以15°C/分钟的速度升至150°C。温度进一步以2°C/分钟的速度升至160°C，然后以15°C/分钟的速度升至215°C，接着以20°C/分钟的速度升至262°C，并保持4分钟。最后，温度以10°C/分钟的速度升至290°C，并在290°C保持3分钟。使用电子轰击离子化模式在70 eV下进行选择离子监测，离子源温度保持在230°C。通过将化合物的峰面积与内标峰面积相关联来实现芳香族化合物的定量。
2.4.4.测定茶多酚对肠道细菌生长的影响
为了监测需氧菌的生长，将5%的接种物接种到含有0.1%相应酚类的肉汤中。使用微生物读数仪在37°C下每10分钟测量420至580 nm处的吸光度，持续24小时。将生长与对照（无茶多酚）进行比较，以确定不同酚类化合物的活性。
对于厌氧菌生长的测定，将5%的接种物在试管中培养，并在厌氧条件下在24小时内监测光密度读数。在0、3、6、9、12和24小时使用试管分光光度计在550 nm处读取OD值。将生长与对照（无茶多酚）进行比较，以确定特定酚类的影响。
3.结果
通过GC-MS检测到的发酵普洱茶提取物中31种不同酚类和芳香族化合物的水平如表1所示。茶提取物中存在的主要酚类化合物，包括表儿茶素、儿茶素、3-氧-甲基没食子酸、没食子酸和咖啡酸，在与粪便细菌匀浆孵育后浓度下降（表2），而其他测量到的芳香族衍生物，包括3-苯基丙酸和4-羟基苯乙酸，则有所增加。因此，我们更准确地检查了这7种芳香族化合物，以及先前已被鉴定为多酚细菌代谢物的3-（4-羟基苯基）丙酸，研究它们对各种肠道细菌物种生长的影响。
表1：茶提取物中多酚成分的浓度分布
茶多酚成分 茶提取物中的浓度 (nmol/g)
苯乙酸 0.29
3,4,5-三甲基羟基苯甲酸 0.01
3-苯基丙酸 0.07
4-乙基苯甲酸 0.5
3,4-甲基羟基苯酚 0.02
4-羟基,3-甲基苯甲醛 0.03
反式肉桂酸 0.01
1,2,3-三羟基苯甲酸 0.78
3,4-二羟基苯甲醛 0.06
4-羟基苯乙酸 0.04
1,3,5-三羟基苯甲酸 5.41
3-(4-羟基苯基)丙酸 0.01
4-羟基,3-甲基羟基苯甲酸 0.01
3-羟基,4-甲基羟基苯甲酸 0.01
3,4-二羟基苯甲酸 0.18
3,4-二苯基乙酸 0.01
4-氧-甲基没食子酸 0.4
4-羟基肉桂酸 0.63
3-氧-甲基没食子酸 33.97
3,4,5-三甲基羟基肉桂酸 0.09
3,4,5-三羟基苯甲酸 (没食子酸) 81.22
3-羟基,5-甲基羟基肉桂酸 0.01
3,4-二羟基肉桂酸 (咖啡酸) 5.70
柚皮素 0.26
鹰嘴豆素A 1.78
表儿茶素 44.86
儿茶素 47.04
染料木素 0.76
芒柄花素 0.01
山奈酚 0.54
槲皮素 4
表2：茶提取物与粪便细菌孵育24小时后主要酚类成分的浓度变化
在测试的每种细菌中观察到八种芳香族化合物的不同生长效应（表3和表4）。在大多数细菌物种中最常见的反应是芳香族化合物对生长的抑制，但程度取决于细菌种类和芳香族化合物。与其他酚类相比，咖啡酸通常对测试的各种细菌产生更显著的生长抑制。在极少数细菌物种中观察到生长刺激，并且仅由一种或两种芳香族化合物引起，但共生梭菌（MD024）和肠炎沙门氏菌ATCC 13076除外，它们的生长分别被七种和五种不同的芳香族化合物促进。
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