变形链球菌的atlA基因编码一种自溶素，这种自溶素是生物膜成熟和正常细胞表面生物发生所必需的。我们发现，这种主要导致龋齿的病原体形成生物膜的能力在通气环境中生长时显著受损，并且暴露于氧气的细胞显示出表面蛋白谱的显著变化。atlA基因的失活缓解了氧气存在下生物膜形成的抑制。此外，AtlA缺陷菌株特征性的长链形成在通气生长的细胞中不太明显。SMu0629基因紧邻atlA上游，编码一种含有C-X-X-C基序的产物，这是硫醇-二硫键氧化还原酶的典型特征。SMu0629的失活显著降低了AtlA蛋白水平并导致对自溶的抗性。SMu0629突变体在氧气存在下也显示出比亲本菌株更强的生物膜形成能力。SMu0629的表达被证明受VicRK双组分系统控制，后者影响变形链球菌的氧化应激耐受性。vicK的破坏也抑制了AtlA的加工，并且突变体对自溶高度抗性。在好氧条件下生长时，vicK突变体也比UA159菌株显示出显著增加的生物膜形成。本研究阐明了AtlA和VicK在协调表面生长和包膜生物发生以响应氧化还原条件中的核心作用。
变形链球菌被认为是人类龋齿的主要病原体。变形链球菌的一个关键毒力特性是它能够在牙齿表面建立结构和组成复杂的生物膜的一部分。一旦在某个位置建立，口腔生物膜随时间保持相对稳定，尽管环境条件不断变化。在这些环境挑战中生存并成为稳定口腔生物膜群落中数量显著的成员是变形链球菌持久性和致龋性的基本要素。最近，我们鉴定了一种表面相关蛋白（SMu0630），该蛋白是变形链球菌UA159正常生物膜形成所必需的。在后续研究中，该蛋白被揭示为生物膜成熟和细胞自溶所必需的。该基因产物因其自溶活性被命名为AtlA。AtlA是正常细胞表面生物发生所必需的，因为AtlA缺陷菌株具有显著减少的可用非离子去污剂提取的表面蛋白补体。此外，AtlA被证明是变形链球菌完全表达遗传能力所必需的。
细菌自溶素能够水解细胞壁的肽聚糖组分，这是一种高度动态的结构，随着细胞生长而扩展，并在细胞分裂或分化时重塑。自溶素通常在整个生长周期中产生，并已被证明在许多关键功能中发挥核心作用，包括细胞壁更新、细胞生长、抗生素抗性、细胞表面粘附、遗传能力、蛋白质分泌和致病性。自溶素活性的调节被认为最常见于翻译后水平，通过底物构象或修饰、通过各种细胞壁结合域与细胞的差异结合、细胞壁中酶复合物的拓扑排列以及输出位点的控制，尽管自溶素的转录控制已被证明。在一些革兰氏阳性细菌中，当细胞达到生长稳定期晚期时，自溶自发发生。这一致命事件被提出为有意义的生物学现象，因为细胞裂解释放的DNA有助于自然感受态细菌的生存和遗传多样性。由β-内酰胺抗生素引起的不可逆效应，如青霉素诱导的细菌溶解，也得到了很好的描述。显示影响自溶素活性或激活的其他因素包括营养限制、质子动势力以及许多影响细胞壁物理化学性质的因素。
影响牙齿生物膜组成和活性的一个关键环境因素是氧气。在人类口腔中，氧气丰富，但定植于口腔各种表面的生物膜支持多种需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧细菌。在清洁釉质表面发展口腔生物膜期间，牙菌斑的氧化还原电位下降，牙菌斑的深层被认为是厌氧的。因此，口腔生物膜的氧张力和氧化环境随部位和生物膜特性变化很大。毫不奇怪，口腔细菌生物膜具有相对活跃的氧代谢，并已发展出防御氧气存在或各种氧化还原环境的能力。
在当前研究中，我们证明了氧气对变形链球菌形成生物膜的能力具有深远影响，并证明氧气影响AtlA的表达和成熟，而AtlA对生物膜形成和正常细胞表面生物发生至关重要。揭示了氧化环境、AtlA生物发生、细胞自溶、双组分信号转导途径和变形链球菌毒力表达之间联系的新见解。
材料与方法
细菌菌株、质粒、培养基和生长条件。 大肠杆菌DH10B在Luria肉汤中生长，变形链球菌UA159及其衍生物在脑心浸液肉汤中生长。遗传转化后选择抗生素抗性菌落时，根据需要向培养基中添加氨苄青霉素、红霉素和卡那霉素。对于生物膜形成测定，变形链球菌菌株在补充有葡萄糖或蔗糖（终浓度20 mM）的半限定培养基BM中的微孔板中生长。基因编号对应于Los Alamos口腔病原体网站注释的编号。
突变菌株的构建。 用于缺失诱变的引物如表1所示。为了在SMu0629、vicR和vicK基因中产生缺失，从变形链球菌UA159的染色体DNA中扩增每个基因的5'和3'侧翼区域，使用设计到每个引物组中的BamHI位点连接在一起，并克隆到pGEM-T Easy载体中。质粒用BamHI消化，并与来自pALH124或pVT924的非极性或极性卡那霉素盒连接，用相同酶消化。诱变质粒用于转化变形链球菌UA159。转化体在含有卡那霉素的BHI琼脂上选择，并通过PCR和测序确认每个基因中的双交换重组。本研究中构建的变形链球菌突变株列于表2。
生长、生物膜和自溶测定。 为了比较生长速率，用变形链球菌过夜培养物的1:100稀释液接种新鲜培养基。在37°C常规时间间隔测量600 nm的光密度或使用Bioscreen C实验室系统监测。Bioscreen C系统设置为每30分钟摇动15秒。对于厌氧条件，将无菌矿物油覆盖在培养物上。还通过相差显微镜观察培养物以记录链长，如先前详细描述。在微孔板中形成稳定生物膜的能力如先前描述测量。通过将板在空气中、含5% CO2的好氧气氛中静态孵育，或在好氧气氛中以150 rpm在旋转摇床上振荡，有或无矿物油覆盖，允许生物膜形成。自溶测定如先前描述进行，略有修改。简要地，在生长指数期晚期的变形链球菌细胞收获，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。将细胞重悬于含有1 M KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2和0.4%叠氮化钠的20 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5）中，至OD550为0.9。细胞悬浮液在44°C孵育，并使用Bioscreen C实验室系统监测细胞悬浮液的OD550来自溶。
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