摘要
洋葱伯克霍尔德菌及伯克霍尔德菌复合体（BCC）的其他成员是高度多重耐药的细菌，可引起囊性纤维化患者的严重肺部感染。对2686种来源于海洋生物的化合物进行筛选，鉴定出能与多粘菌素B（PMB）协同抑制洋葱伯克霍尔德菌生长的分子。在1μg/mL浓度下，五种化合物与PMB协同作用，使洋葱伯克霍尔德菌的生长抑制≥70%，相比单独使用PMB。后续测试显示，筛选中的一种化合物，氨基香豆素抗生素新生霉素，与PMB和粘菌素协同作用，对抗妥布霉素耐药的临床分离株洋葱伯克霍尔德菌和多重伯克霍尔德菌。同时，我们发现新生霉素敏感性在BCC物种中常见，且这些细菌对另一种氨基香豆素氯新生霉素更敏感，后者与PMB对洋葱伯克霍尔德菌也具有相加效应。这些研究支持使用氨基香豆素抗生素治疗BCC感染，并表明可以找到协同剂来增强抗微生物肽和多粘菌素对BCC细菌的效力。
1.引言
多重耐药性的惊人增加，特别是内在的高水平耐药性，削弱了改善慢性病患者健康和延长寿命的新治疗方法。例如，囊性纤维化（CF）患者慢性肺部细菌感染导致的呼吸衰竭阻碍了过去几十年生存率的提高，并且仍然是主要死因。内在多重耐药的CF病原体不断出现，如伯克霍尔德菌复合体（BCC）细菌、嗜麦芽窄食单胞菌、木糖氧化无色杆菌和非结核分枝杆菌，这迫切需求新疗法。多重耐药细菌数量的增长，以及缺乏新抗生素来对抗它们，导致多粘菌素（一类脂联抗微生物肽（AMPs））的复兴，作为最后手段的治疗，尽管先前报道了其全身毒性。不幸的是，BCC细菌也对这类化合物耐药。我们研究了治疗策略，以破坏BCC的高水平内在多重耐药性，使用洋葱伯克霍尔德菌作为模型细菌。洋葱伯克霍尔德菌是一种环境机会病原体，属于BCC，可引起CF患者的严重呼吸道感染。这些感染与肺功能更快下降、debilitating exacerbations和最终死亡相关，并且它们还降低了CF患者肺移植后的生存率。
抗微生物佐剂是抑制细菌抗生素耐药机制的分子，有效增加细菌对该抗生素的敏感性。这一概念已被研究作为逆转细菌抗生素耐药性的有吸引力的方法。在这里，我们使用一种策略，通过筛选来源于海洋的天然分子库，鉴定与多粘菌素B（PMB）协同对抗洋葱伯克霍尔德菌的化合物。这些协同剂降低了洋葱伯克霍尔德菌和其他BCC细菌对PMB和粘菌素（多粘菌素E）的极端耐药性，从而提高了它们的抗微生物有效性。临床上，这可以提供一种有效的方法来减少多粘菌素的剂量，从而提高其疗效，同时克服其毒性作用。
2.材料和方法
2.1.细菌菌株
洋葱伯克霍尔德菌K56-2用于初始筛选；该分离株来自CF患者，是洋葱伯克霍尔德菌ET-12流行克隆谱系的常用原型菌株。后续研究使用先前描述的BCC菌株组以及两株妥布霉素耐药的洋葱伯克霍尔德菌CF分离株（GIB-C1141144和GRI-C1210932）。
2.2.筛选化合物库以寻找与多粘菌素B的协同作用
该库包含2686种来源于海洋生物的化合物，由Biomar Microbial Technologies（莱昂，西班牙）分离和表征。这些化合物的溶液被接种到一对100孔Bioscreen C板（Growth Curves USA,Piscataway,NJ）中，溶剂被蒸发。洋葱伯克霍尔德菌K56-2的过夜培养物在新鲜LB肉汤（Becton Dickinson&Co.,Franklin Lakes,NJ）中稀释至600nm光密度（OD600）为0.0002，并加入板中（300μL/孔），溶解化合物至最终浓度1μg/mL。板对在Bioscreen C自动生长曲线分析仪（Oy Growth Curves AB Ltd.,Helsinki,Finland）中于37°C连续中等振荡培养。
2小时后，PMB以最终浓度500μg/mL加入一个板中，而PMB溶解的载体对照（0.2%牛血清白蛋白和0.01%乙酸）加入另一个板中。该PMB浓度对洋葱伯克霍尔德菌K56-2的生长影响很小（数据未显示）。每对板中也包含无化合物的孔。板进一步在37°C孵育，每30分钟读取OD600。此外，每板有一个孔无化合物，接收无菌LB加载体对照或PMB，作为阴性对照，并确认每个实验在无菌条件下进行。该实验设计允许鉴定对洋葱伯克霍尔德菌有直接抗微生物活性的化合物以及与PMB协同的化合物。
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