2.3抑制物胁迫下原始菌株和驯化菌株的发酵性能比较
为了更好地评价驯化后酵母菌株对抑制物的耐受性影响，对含有不同浓度抑制物的葡萄糖发酵液中原始酵母菌株和驯化菌株的乙醇发酵性能进行了研究。在酿酒酵母的亲本菌株培养中，添加2.0 g/L糠醛可以显著抑制细胞生长，培养基中葡萄糖的含量几乎未被消耗。与W303-1A相比，驯化后的5株菌在48 h内达到稳定，具有通常观察到的滞后期，并完全消耗葡萄糖(50 g/L)，表明驯化后的菌株已经适应了糠醛环境。在相同的糠醛胁迫条件下，F-2菌株的生长明显优于其他驯化菌株，发酵24 h时，F-2菌株乙醇产量为8.96 g/L，比其他4株驯化菌株高2.43−6.29 g/L(图3A、3B)，这一结果与之前的梯度稀释实验结果一致。随着发酵时间的延长，驯化后的5株菌最终的乙醇浓度几乎相同，而出发菌株W303-1A最终的乙醇浓度约为2.66 g/L，远低于驯化后菌株的发酵效率。驯化菌株在培养基中消耗了几乎所有的葡萄糖，最大乙醇浓度为19.40 g/L，葡萄糖转化率为94.4%。以上结果表明驯化菌株具有较高的糠醛耐受性，乙醇产量比出发菌株高2倍。Li等将酿酒酵母菌株E7在复合抑制剂中驯化，获得进化菌株E7403在36 h即可消耗培养基中全部葡萄糖(50 g/L)，最终的乙醇产量也比原始菌株E7多了22.9%。Liu等利用进化工程获得了一株对糠醛和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)耐受的菌株，其在20 mmol/L的糠醛和HMF的存在下，48 h葡萄糖被完全消耗且乙醇产量正常，相比之下，原始菌株的细胞生长则完全被抑制，未产生显著的乙醇。这一结果与本研究观察到的现象相似。
图3不同浓度的糠醛、对羟基苯甲酸和糠醛+对羟基苯甲酸抑制胁迫下原始菌株和驯化菌株的发酵性能比较。
A：2.0 g/L糠醛抑制下的葡萄糖和OD600浓度变化；B：2.0 g/L糠醛抑制下的乙醇浓度变化；C：2.0 g/L对羟基苯甲酸抑制下的葡萄糖和OD600浓度变化；D：2.0 g/L对羟基苯甲酸抑制下的乙醇浓度变化；E：1.6 g/L糠醛+对羟基苯甲酸抑制下的葡萄糖和OD600浓度变化；F：1.6 g/L糠醛+对羟基苯甲酸抑制下的乙醇浓度变化。
本研究测试了出发菌株W303-1A和驯化菌株在含2.0 g/L对羟基苯甲酸的葡萄糖培养基中的发酵情况(图3C、3D)。所有的菌株均能在含有对羟基苯甲酸的培养液中生长，对照菌株和驯化后的5株菌生长和发酵响应相当，在发酵12 h时，原始菌株出现生长迟缓，但细胞生长在指数期不受影响。这一结果表明，在发酵前期，驯化后的菌株会导致生长速度的增加。原始菌株在72 h的葡萄糖发酵过程中能够产生与驯化菌株相似的乙醇量，但在发酵12 h后观察到乙醇产量的降低，这可能是由于发酵液中部分乙醇挥发导致的。因此，与上述糠醛对酵母发酵性能的结果相比，对羟基苯甲酸的抑制能力远低于糠醛对酵母细胞生长的抑制，而驯化后的酵母菌株则能有效提升细胞对抑制物的耐受性。
在相同的培养条件下，用含有1.6 g/L糠醛和对羟基苯甲酸的发酵培养基进行发酵性能测试(图3E、3F)。原始菌株在含有抑制物的发酵液中细胞生长完全被抑制，其OD600值和发酵液中葡萄糖的含量几乎无变化。在添加1.6 g/L糠醛和对羟基苯甲酸的条件下，被驯化后的5株菌生长响应相当。与出发菌株W303-1A相比，驯化后菌株的葡萄糖消耗速度更快、消耗量更大，其中B-2和B-4菌株在48 h内完全消耗葡萄糖，B-1、B-3和B-5菌株在72 h后发酵液中的葡萄糖含量也被消耗完全。B-2菌株的乙醇产生速率比其他4株驯化菌都要快，且在48 h获得最大乙醇浓度，为20.22 g/L，葡萄糖转化率为98.4%，比在糠醛抑制物下驯化菌株高4.0%。B-2菌株产生的乙醇浓度是出发菌株的7.6倍。在混合抑制物胁迫下的生长和发酵响应规律与单一抑制物存在的时有所不同，这可能是两种抑制物间存在协同作用。研究表明多种抑制物的协同作用对发酵性能的影响高于单一发酵抑制物。Wang等通过协同因子(continuous integration,CI)值来判断化合物是否具有协同作用，得出糠醛，香草酸，HMF和甲酸对酵母的生长具有明显的协同抑制作用，同时对胞内ADH酶活和ATP含量也可能具有协同抑制作用，且协同抑制作用大于单一抑制作用。因此本研究利用糠醛和对羟基苯甲酸对酵母菌株进行驯化十分有意义，结果也表明驯化后的菌株对混合抑制物的耐受显著增强，或许一定程度上了解除了乙醇发酵中的抑制物协同作用。
本研究利用驯化策略在不同程度上提高了酿酒酵母在单一和混合抑制物胁迫下的生长和发酵性能。研究表明微生物通过短期驯化获得的抑制物耐受表型不能在后代中稳定遗传，并有学者推测发生抑制物耐受性提高现象的原因是短期抑制物压力胁迫使酵母产生应激作用，并形成了对酚酸应激反应的转录记忆而未发生相关基因突变。因此本研究选取在上述实验中发酵和生长表型优异的进化菌株F-2、A-2、B-2进行基因组重测序，进一步了解基因型与表型的关系。
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