为了分离出可用于研发驴用微生态制剂的乳酸杆菌，采集健康驴新鲜粪样4份，通过分离培养、形态特征、培养特性筛选出革兰氏阳性，厌氧，无芽孢杆菌1株。通过生理生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离菌株为干酪乳杆菌，编号为LV1。生物学特性研究结果表明，干酪乳杆菌LV1安全，无致病性，适宜生长温度范围为30～40℃，培养液初始pH3～8条件下均能生长。研究为研发驴用乳酸杆菌微生态制剂奠定了基础。
驴是草食家畜，饲草为主要日粮，饲喂量不足或饲喂质量较差的饲草将影响驴消化系统功能、机体健康和生产性能，制约驴养殖业发展。
乳酸杆菌（Lactic acid bacteria，LAB）是动物肠道中的优势菌群和常在菌群，可发酵产生大量有机酸、消化酶、维生素、抑菌物质等代谢产物，调节菌群平衡，增强免疫力。通过乳酸杆菌的发酵作用，将富含粗纤维的农作物秸秆，转变为优质的驴用生物发酵粗饲料，替代饲草粗饲料，在提高驴生产性能同时缓解饲草缺乏压力，促进生物质资源利用。
研究拟从健康驴肠道内分离乳酸杆菌，研究其生物学特性，为研发驴用微生态制剂和驴用生态饲料，促进驴养殖业发展奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
前往黑龙江省三头驴农业科技有限公司种驴繁育基地，无菌采集健康驴新鲜粪便4份，冷藏并迅速送实验室进行细菌分离。
1.1.2培养基
MRS肉汤和MRS琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司，用于乳酸杆菌分离培养。
1.1.3主要试剂
细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司，细菌DNA提取试剂盒、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2方法
1.2.1样品处理
将无菌采集的健康驴新鲜粪样置于盛有50 mL灭菌生理盐水含玻璃珠的锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床，180 r·min-1振荡5 min，然后进行10倍系列稀释，自10-1至10-9，共9个稀释度。
1.2.2菌株分离、染色和镜检
分别取适宜稀释度的粪样混悬液0.1 mL涂布于MRS平板，37℃恒温厌氧培养24～48 h。挑取各种不同菌落进行革兰氏染色，镜检，观察菌体形态。
1.2.3菌株的纯化
挑取MRS琼脂培养基平板上的疑似菌落进行纯化，纯化好的菌株进行菌落形态观察，并描述各菌株的菌落形态特征。
1.2.4乳酸杆菌生化鉴定
依据《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定及实验方法》中乳酸杆菌属和种的生理生化鉴定指标，首先通过厌氧生长试验、运动性试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，吲哚试验，初步确定乳酸杆菌属。再通过糖醇类发酵产酸试验，包括葡萄糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、松三糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖酸盐、甘露醇、山梨醇、七叶苷、水杨素等，以确定乳酸杆菌种。
1.2.5乳酸杆菌PCR鉴定
提取菌株LV1基因组DNA，采用干酪乳杆菌16S rDNA鉴定引物，上游引物P1：5’-TGGTCGGC AGAGTAACTGTTGTCG-3’，下游引物P2：5’-CCAC CTTCCTCCGGTTTGTCA-3’，扩增片段大小为727 bp，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系（25μL）：PCR Premix 12.5μL，P1、P2各0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火复性40 s，72℃延伸2 min，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析仪观察结果。