Bio-5'-AMP合成反应
如先前所述²⁸进行BirA催化的体外蛋白质生物素化活性测定，略有修改。使用ExPASY Tools网站根据蛋白质序列计算的消光系数确定蛋白质浓度。测定体系包含50mM Tris-HCl(pH 8)、5mM Tris-(2-羧乙基)膦、5mM MgCl₂、20μM生物素、5μM ATP加16.5 nM[α-³²P]ATP、100 mM KCl和2μM BirA蛋白。每个反应混合物在37°C孵育30分钟。对于每个测试的BirA蛋白，使用两个相同的管，在30分钟反应结束时，向每对管中的一个加入AccB87（50μM），另一个管不作处理。管子再在37°C孵育15分钟。将每种反应混合物1μl点样到微晶纤维素薄层色谱板上，用异丁酸-NH₄OH-水（66:1:33）展开²⁹。薄层色谱板干燥10小时，暴露于磷屏成像板，并使用Fujifilm FLA-3000磷屏成像仪和Fujifilm Image Gauge软件（Mac OS版本3.4）可视化。
质谱分析
使用MALDI TOF/TOF质谱仪测量BirA催化的AccB87生物素化水平。反应体系包含100μM AccB-87、3μM BirA、100μM生物素、1 mM ATP、10mM MgCl₂、100mM KCl、5mM tris-(2-羧乙基)膦，溶于50mM Tris-HCl(pH 8)中，在37°C孵育16小时。在进行低分辨率基质辅助激光解吸/电离分析之前，将混合物在25 mM乙酸铵中透析并冻干至干。使用FlexAnalysis 3.3软件包（Bruker Daltonics）进行数据处理。使用软件包的内置功能对光谱进行平滑处理和基线校正。
电泳迁移率变动分析
如先前所述²⁶,³⁰,³¹进行凝胶迁移实验，以探测BirA1_LL（和BirA2_LL）蛋白与乳酸乳球菌和猪链球菌2的bioY启动子的结合。通过退火两个互补的寡核苷酸制备两组DNA探针（bioY_LL和bioY_SS）（bioY_LL-F:5'-CAA ATA ATA AAA TTA ACA GTT AAC CTA AAT TTG ATT TTA GGG TTA CTG TTT GAT ATG-3'；bioY_LL-R:5'-5'-CAT ATC AAA CAG TAA CCC TAA AAT CAA ATT TAG GTT AAC TGT TAA TTT TAT TAT TTG-3'）。在结合缓冲液（Roche）中，将纯化的BirA1_LL（和BirA2_LL）蛋白按一系列稀释度与地高辛标记的DNA探针（约0.2 pmol）混合。如果需要，加入生物素酰-5'-AMP配体。DNA/蛋白质混合物在天然7%PAGE上进行分离。
生物信息学分析
使用ClustalW2程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）对BirA的两种直系同源物和BirA结合位点进行多序列比对，最终输出通过ESPript 2.2程序（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）给出。使用中性网络启动子预测服务器（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）预测转录起始位点。使用CPHmodels 3.2服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels）进行结构建模，使用适当的结构模板：BirA_ec（PDB:1HXD）用于BirA1_LL；嗜热氢菌BirA（PDB:3EFS）用于BirA2_LL；ECF型ABC转运蛋白的S组分（PDB:4DVE）用于乳酸乳球菌的两个BioY直系同源物。
³H-生物素转运
乳酸乳球菌在THB中过夜培养。取1 ml样品离心沉淀，用PBS洗涤三次，并接种到补充了1 nM或1μM生物素的基本培养基中。样品生长4.5小时，离心沉淀，并用PBS洗涤三次以去除外部生物素。然后将沉淀物重悬于含有0.5%葡萄糖的PBS中进行转运测定⁶，并使用Bio-Rad蛋白质测定法对每个样品中的总蛋白质进行定量。对于转运测定，样品在30°C下与0.5μM³H-生物素一起孵育0.5、1、2、5、30或60分钟。通过用冰PBS稀释来终止反应，并将细菌收集在0.45μm过滤器上。然后将过滤器与闪烁液混合，并使用Packard闪烁计数器计数DPM。
结果与讨论
乳酸乳球菌中生物素代谢基因的冗余
与其近亲人畜共患病原体猪链球菌¹⁵类似，乳酸乳球菌也是一种低GC革兰氏阳性细菌，具有简化基因组（GC百分比35.3%，2.37 Mb）。然而，令人意外的是，乳酸乳球菌的基因组织在生物素代谢背景下呈现基因重复和/或冗余。与猪链球菌仅编码一个birA基因和一个bioY基因不同，乳酸乳球菌有两个birA直系同源物（称为birA1[L0191]和birA2[L0192]，表S1）和两个bioY直系同源物（分别为bioY1[L24031]和bioY2[L1011]）。birA2基因编码一个推定的“简单”生物素蛋白连接酶（BPL），缺乏在推定的双功能birA1中发现的N端DNA结合基序（图1和2）。虽然存在多个birA和bioY同源物拷贝是非典型的，但在弗朗西斯菌属中发现了两个birA拷贝，在副球菌属¹²中存在两个不同的bioY直系同源物。除了birA和bioY的冗余外，乳酸乳球菌脂肪酸合成基因座内也存在冗余（表S1）。乳酸乳球菌中存在三个fabG（3-氧酰基-ACP还原酶）基因座，即fabG1（L0185）、fabG2（L27694）和fabG3（L1530）。值得注意的是，Wang和Cronan报道fabG2不是活跃的3-氧酰基-ACP还原酶¹⁷，表明这些fabG基因座可能在糖代谢中发挥作用。此外，乳酸乳球菌有两个编码3-羟酰基-ACP脱水酶的基因座（fabZ[L0188]和fabZ1[L160425]）。乳酸乳球菌还有两个脂肪酸降解（fad）基因（fadA[L25946]和fadD[L54546]），而链球菌属的fad系统是隐性的。这些基因安排表明，与其近亲猪链球菌相比，乳酸乳球菌的脂质代谢（包括生物素利用）具有意想不到的复杂性。
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