2结果
2.1产果胶酶菌株的分离筛选
利用产果胶酶的菌株可以使加溴酚蓝的培养基产生黄色水解圈的原理，本实验从土壤、腐烂水果等生境复筛得到黄色水解圈较大的7株霉菌（见图1和图2），对其进行Dp/Dc值及酶活性的测定，结果见表1.
图1筛选所获部分菌落图
图2 L5菌株的培养特征和形态特征
表17株产果胶酶菌株的Dp/Dc值和酶活性比较
由表1可以看出，菌株的酶活性随着Dp/Dc值增大而增大，L5菌株的Dp/Dc值最高，相应的酶活性为39940 U·min-1·mL-1.L5菌株是从浙江东阳荷塘淤泥中筛选得到的。图2（a）为L5菌株在溴酚蓝筛选培养基上的黄色水解圈照片。
2.2培养时间对L5菌株产果胶酶的影响
对每隔2 h取样得菌体进行干质量测量，并绘制生长曲线见图3.由图3可知：将菌体从种子培养基中接入摇瓶培养基约需0——10 h的停滞期；接着10——24 h,菌丝生长，菌体质量进入对数期；其后曲线趋于平缓，24——68 h是菌体质量的稳定期；从68 h始，菌体开始自溶，进入衰亡期。
每隔2 h测量一次L5菌株产生的果胶酶酶活性，以酶活性为纵坐标、培养时间为横坐标绘制曲线（见图3）。由图3可知：在2——70 h内，L5菌株产果胶酶的活性逐渐上升，在菌体稳定期结束时酶活性达到最大值39940 U·min-1·mL-1;在76——80 h内，果胶酶的活性下降。
图3 L5菌株的生长曲线
2.3 L5菌株的分类鉴定
2.3.1形态学鉴定
1）培养特征：PDA培养基上，28℃培养3 d即形成较典型的菌落，菌落中间呈蓝绿色，边缘为白色，直径约19 mm,轮廓规则，外观呈绒毛状。
2）形态特征：28℃PDA培养基上培养3 d,显微镜下观察L5菌株的菌丝形态、分生孢子梗的分枝情况、帚状枝及瓶梗的类型等显微形态特征。由图2可见：菌丝细胞丝状交织，具横隔；分生孢子梗不具足细胞，帚状枝为对称双轮型，瓶梗细长渐变尖锐；分生孢子椭圆形，呈蓝绿色。
2.3.2 ITS的PCR扩增与序列分析
用真菌通用引物ITS1/ITS4对L5菌株进行PCR扩增，获一长度为572 bp的目的片段。将测序所得序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）进行BLAST比对和同源性分析，结果表明L5菌株的ITS序列与Penicillium oxalicum同源性最高达99%.基于L5菌株的ITS序列建立的系统发育树见图4,结合形态特征鉴定，将L5菌株鉴定为草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）。
图4基于L5菌株的ITS序列建立的系统发育树
3讨论与结论
果胶酶的研究应用迄今已有70多年的历史，其用途广泛，现阶段产量已是世界四大酶制剂之一，而中国现有的生产果胶酶工艺存在着很多问题，如固体发酵成本高、生产率低、易染菌等。面对国外果胶酶产品的优势，我国必须利用丰富的微生物资源，研究新的生产工艺，加紧筛选出拥有自主知识产权、低成本、无污染、满足市场需求的商业化果胶酶。
本研究从污泥中筛选得到一株高产果胶酶的菌株，对其进行了形态学鉴定，并对其进行了ITS测序，确定其为草酸青霉菌。该菌的ITS序列基因已登录GenBank,登录号为：HQ680452.
本研究利用浙江来源丰富的桔皮和米糠作为摇瓶培养基材料，研究表明：该菌株在28℃，培养基初始pH 6.0,转速160 r/min的条件下，培养70 h果胶酶活性最高，可达39940 U·min-1·mL-1;并且，该菌株利用成本低廉、天然、含果胶的植物材料为培养基，不仅实现了废物再利用，也可以使其高产。可见，对该菌株的研究具有潜在的意义，其应用前景广阔。