水稻是世界第二大粮食作物，在我国粮食生产中占据重要地位，细菌病害是制约水稻种植的主要因素。水稻白叶枯病(bacterial leaf blight of rice，BLB)是影响水稻产量最严重的三大细菌性病害之一，又称过火风、白叶瘟。水稻白叶枯病分布广泛，于1884年在日本发现，之后在包括中国、泰国、印度尼西亚等亚洲以及大洋洲、美洲、非洲等水稻种植地区均有发现。黄单胞菌是一种革兰氏阴性菌，它具有2个致病变种，其中水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是引起水稻白叶枯病的病原菌。水稻白叶枯病主要危害叶片，一般先从叶尖或叶缘开始侵入，在叶片上形成黄绿或暗绿色斑点，继而扩展为水渍状短条斑，再变成灰白色，最后呈干枯脱水状。该病若发生在抽穗期，则会导致水稻粒重减少，结实率下降，使水稻减产10%~30%，严重时甚至减产50%以上，给我国粮食安全造成巨大威胁。水稻白叶枯病的防治一般分为农业防治、化学防治、生物防治等。化学防治是防治病虫害最经济有效的措施。20世纪80年代主要使用叶枯唑等化学药剂来防治水稻白叶枯病，由于长期连续使用，其药效明显下降，已于2016年11月停用。目前国内登记在册用于防治白叶枯病的药剂仅有噻唑类化合物。此外常见的Cu2+杀菌剂和抗生素等也具有药效差、植物毒性高和容易产生耐药性等缺点。因此化学药剂防治效果欠佳，公众迫切需要寻找一种有效的杀菌剂以应对水稻白叶枯病。噬菌体凭借其宿主特异性、安全高效等优势逐渐成为了新型抗菌剂的研究热点之一。
噬菌体是一种能够侵染细菌的病毒，广泛存在于各个地方，是地球上最丰富的生物体。根据生活史不同，噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体。烈性噬菌体通过吸附、侵入、增殖、装配和裂解5个阶段杀灭病原菌。相较于抗生素，烈性噬菌体具有宿主特异性、不影响其他微生物群落正常生长、安全高效等优势，被认为是一种绿色天然的抗生素替代物。1919年，Żaczek等发现噬菌体并利用其成功治愈了痢疾，噬菌体疗法开始萌芽并迅速得到发展;然而随着20世纪40年代抗生素的发明，噬菌体研究陷入了停滞。直至21世纪初，抗生素过度使用导致多重耐药细菌的出现，世界公共卫生安全受到威胁，噬菌体才重新得到关注。近年来，噬菌体研究不断深入发展，在农业、水产养殖、食品等领域均取得不少成果。使用噬菌体VPp1对感染副溶血性弧菌的牡蛎进行除菌，比工厂使用臭氧净化效果更好;利用噬菌体以防御造成马铃薯软腐病的欧文氏杆菌，能够对马铃薯的贮藏起到保护作用。2006年，随着首个噬菌体产品ListShield作为食品添加剂通过了美国食品和药物管理局(FDA)的审批，至今已有多个噬菌体产品成功上市，可见噬菌体在防控细菌感染方面表现出了巨大应用潜力。
目前关于使用噬菌体防治白叶枯病的报道较少。刘锦将从土壤中分离得到黄单胞菌噬菌体Xoo_sp13、Xoo_sp14、Xoo_sp15制成鸡尾酒制剂，能使水稻中PXO99A菌株下降2个数量级。Liu等分离得到的2株广谱噬菌体pXoo2106和pXoo2107单独或组合使用均可有效抑制Xoo在体外的生长。Jain等研究表明，噬菌体vB_XooS_NR08在水稻盆栽试验中，添加噬菌体减少了90.23%和79.27%的白叶枯病菌。Jiang等报道，黄单胞菌噬菌体J2、J3和E混合使用能有效降低64.30%的白叶枯病害指数。Ogunyemi等在接种黄单胞菌前后给水稻喷施噬菌体X3均能显著降低白叶枯病发病率，且其用于种子消毒也非常有效。为丰富黄单胞噬菌体资源库，本研究使用黄单胞菌Xoo 2068作为宿主，从稻虾田水中分离得到一株能裂解水稻黄单胞菌的噬菌体，并对其全基因组、生物学特性和体外抑菌能力等进行相关研究，以期为噬菌体应用于防治水稻白叶枯病提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株及样品来源
本研究所使用的17株白叶枯病菌(表1)由广东省农业科学院植物保护研究所提供。在广东省广州市南沙区大岗镇下坦村水稻种植基地的稻虾田中采集水样5 L用于噬菌体分离。
表1噬菌体HDB2的宿主谱
+: 噬菌体能感染该菌株, -: 噬菌体不能感染该菌株。“+”表示噬菌斑大小在5 mm以下, “++”表示噬菌斑大小在5~8 mm之间, “+++”表示噬菌斑大小在8~10 mm之间, “+++++”表示噬菌斑大小大于10 mm。
1.1.2主要试剂
营养肉汤(nutrient broth)培养基、营养琼脂(nutrient agar)培养基、技术琼脂、牛肉膏提取物，购于广东环凯微生物科技有限公司;硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、吐温80、氯化钙、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、无水乙醇，购于上海沪试化工有限公司;PEG-8000、SM Buffer、Tris饱和酚溶液、EcoR I、BamH I、Hind III、琼脂糖、Gold View核酸染料、DNA Marker，购于生工生物工程(上海)股份有限公司;DNase I、RNase A、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)，购于广州怡和生物科技有限公司;氯化铯购于国药集团化学试剂有限公司。
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