微生物
细菌
使用Escherichia coli（大肠杆菌）ATCC 25922、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）ATCC 9027和Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）ATCC 25923。所有培养物在含有20%甘油的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中于-70°C保存，并在37°C下培养24小时以获得亚培养物，随后将亚培养物接种于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上，于37°C培养24小时。工作培养物由亚培养物在Mueller-Hinton肉汤中于37°C培养4小时制备，并使用0.5麦氏浊度标准（Biomérieux Inc.）调整至1.5x10^8 CFU/ml的浓度。
真菌
Candida albicans（白色念珠菌）CMPUJH022在含有20%甘油的Oxoid麦芽提取肉汤（英国Basingstoke,Hampshire）中于-70°C保存，并在麦芽提取物中于37°C培养24小时以获得亚培养物，随后将亚培养物接种于Sabouraud琼脂（Merck，德国）上，于37°C培养24小时。工作培养物由亚培养物在Sabouraud琼脂上于37°C培养4小时制备，并使用0.5麦氏浊度标准（Biomérieux Inc.，法国Craponne）调整至1.5x10^8 CFU/ml的浓度。
Aspergillus niger（黑曲霉）ATCC 16404在Sabouraud琼脂上于25°C培养5天。使用2毫升无菌生理盐水从该培养物中回收分生孢子，并分装成100微升以备后用。为获得单孢子培养物，将100μl分生孢子溶液大量接种于Sabouraud琼脂上，然后，将滤纸片（5毫米）置于琼脂上，并在25°C下培养5天。
气相色谱法(GC-FID)
精油的气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析在3900气相色谱仪（Varian，荷兰）上进行，配备火焰离子化检测器。使用的色谱柱是Elite 5 MS柱（30 m x 0.25 mm x 0.25μm）（Perkin Elmer，荷兰）。使用氦气作为载气，流速为1mL/min。柱温箱程序初始为50°C保持2分钟，以4°C/min的速率升至160°C保持5分钟，以8°C/min的速率升至220°C保持2分钟，以15°C/min的速率升至280°C保持5分钟。进样口和火焰离子化检测器温度分别为250°C和290°C。每份精油注射1μL，分流比为1:200。
质谱分析(GC-MS)
GC-MS分析使用Agilent Technologies-6850 Series II气相色谱仪（GC），配备DB-5MS（5%苯基甲基聚硅氧烷）柱（60 m x 0.25 mm x 0.25μm）（Agilent Tech.,USA）和HP-INNOWAX柱（60 m x极0.25 mm x 0.25μm）（Agilent Tech.,USA），并配备Agilent 5975B质谱选择性（MS）检测器，在全扫描模式下使用，以监测质量单位从30到500 m/z，电子轰击能量为70 eV。使用氦气作为载气，流速为1 mL/min。进样口和检测器温度分别为250°C和230°C。四极杆温度为150°C。使用DB-5MS柱时的DB-5MS柱温箱程序为：第一分钟120°C，然后以5°C/min升至250°C保持5分钟，以30°C/min升至320°C保持5分钟，最后300°C保持5分钟。使用HP-INNOWAX柱时的柱温箱程序为：第一分钟60°C，然后以6°C/min升至220°C；最后220°C保持3分钟。每份精油注射1μL，分流比为1:200，水馏液的注射制备前文已说明。
水馏液气相中化合物的同时提取和浓缩使用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术进行，使用一根涂有65μm厚PDMS/DVB的熔融石英纤维，购自Supelco（美国宾夕法尼亚州Bellefonte）。色谱分析使用先前使用的相同色谱仪、色谱柱和条件进行，except进样以不分流模式使用SPME装置（美国宾夕法尼亚州Bellefonte）进行。
精油和水馏液成分的鉴定通过将质谱与NIST库中报道的质谱进行比较，以及与正构烷烃相关的保留指数（由Adams报道的）以及其他文献数据进行比对来完成。
ABTS自由基清除活性
通过评估2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除活性来测定精油和水馏液的抗氧化活性，如Re等人所述。从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得的ABTS自由基是通过将20 mg/l ABTS与2.5 mg/l过硫酸钾（K₂S₂O₈）（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）在去离子水中混合，在黑暗中于室温下保持16小时制备的。其在740 nm处的吸光度调整至0.73。首先，为每个样品制备6个连续的2倍稀释系列，以确定其最佳浓度范围，并继续使用4个稀释范围。这些稀释液使用乙醇制备，将每种稀释液10μl加入240μl ABTS中。然后，分别为百里香和迷迭香精油定义了2倍浓度范围；0.75至6和250至2000μL/L。每个实验在不同的时间进行三次重复。读取740 nm处的初始吸光度，然后每5分钟读取一次，总共120分钟。使用公式（%）=[(A₀-A)/A₀]x 100计算抑制百分比，其中A₀是对照吸光度（即不含样品的ABTS），A是含样品的ABTS在t时间的吸光度。通过计算抑制百分比对样品浓度作图，得到使ABTS减少50%所需的样品浓度（IC₅₀）。使用从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买的Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸）作为合成抗氧化剂参考。
抗菌活性测定
微孔稀释法
采用带有BIOSCREEN C微生物生长分析仪（Labsystems，芬兰赫尔辛基）的微孔稀释法，如Medina等人所述，用于确定对Escherichia coli（大肠杆菌）、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）、Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）和Candida albicans（白色念珠菌）的抗菌活性。BIOSCREEN C报告光密度，代表细胞生长引起的浊度。制备150μl细菌溶液（细菌使用Mueller-Hinton肉汤（MHB），C.albicans使用麦芽提取物（Oxoid Ltd,英国Basingstoke,Hampshire）），其中包含工作培养物（制备方法如前所述），然后加入150μl每种精油和水馏液样品的稀释液（使用二甲基亚砜（DMSO-Sigma-Aldrich,美国密苏里州圣路易斯）制备）。
使用三个含有300μl单独MHB的孔作为阴性对照，另外三个孔作为阳性对照，其中对E.coli（大肠杆菌）和P.aeruginosa（铜绿假单胞菌）使用庆大霉素（Oxoid Ltd）（100μg/ml），对S.aureus（金黄色葡萄球菌）使用万古霉素（Oxoid Ltd）（100μg/ml），对A.niger（黑曲霉）使用伏立康唑（Sigma-Aldrich,美国圣路易斯）（10μg/ml），对C.albicans（白色念珠菌）使用两性霉素B（Sigma-Aldrich,美国圣路易斯）（1250μg/ml）。
最后，通过将每种测试溶液5μl倒入培养皿中，于37°C培养24小时（针对E.coli、P.aeruginosa、S.aureus和C.albicans），并应用噻唑蓝四唑溴化物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物]（MTT,Sigma Aldrich,美国密苏里州圣路易斯）测定法评估细胞活力（如Mosmann所述），来确认最低杀菌浓度（MBC）和最低抑菌浓度（MFC）。每个实验在不同的时间进行三次重复。
琼脂稀释法
使用琼脂稀释法确定精油和水馏液对Aspergillus niger（黑曲霉）的最低抑菌浓度（MFC），如Hammer等人所述，并进行了修改。将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基与连续稀释的精油和水馏液在极30°C下制备；在其凝固之前，倒入小培养皿中。然后，将一片带有A.niger（黑曲霉）单孢子培养物（如前所述制备）的圆片置于培养皿中心，并在25°C下培养极5天。MFC定义为无生长的最低浓度。每个assay重复三次，每次三个重复。定义MFC的平均值。用单独PDA制备三个阴性对照，并用伏立康唑10μg/ml制备三个阳性对照。用于精油和水馏液的浓度范围与微孔稀释法中使用的相同。
统计分析
进行方差分析，并使用SPSS 11程序通过单因素方差分析（ANOVA）评估变量间差异的显著性。P<0.01的差异被认为具有统计学意义。