随着近些年来人们对酿酒酵母研究的深入,发现当以酿酒酵母作为底盘细胞用于合成生物学或工业生产时,存在众多局限性,于是越来越多研究者将目光转入非常规酿酒酵母上,鲁氏酵母便是其中一种。鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)属于半子囊菌酵母,是一种耐盐产醇的非酿酒酵母,菌落呈白色粘稠状,在光学显微镜下观察呈梭状。由于鲁氏酵母可以耐受更高的渗透压,因此在高渗透压的食品工业中得到广泛的应用。相对于实验室培养,工业生产对于菌株生长的抗逆性要求更高,在面对某些特殊环境压力时,鲁氏酵母表现出更优良的稳定性。


为了高效地实现对鲁氏酵母的基因编辑,解决含有酿酒酵母的着丝粒序列的质粒在鲁氏酵母内遗传稳定性差的问题,提出一种可以在鲁氏酵母内稳定且高效表达的质粒系统,并将其用于后续鲁氏酵母内建立基因编辑系统。具体是通过生物信息学方法预测鲁氏酵母源的ARS和CEN元件,将它们构成着丝粒型游离质粒;然后通过电穿孔转化法,将上述构建好的质粒转入到鲁氏酵母MQ1中;最后与转入含酿酒酵母的着丝粒序列的质粒的鲁氏酵母重组菌株比较,通过测定相应重组菌株的生长曲线以及质粒丢失率来表明具有鲁氏酵母源ARS和CEN元件的质粒转入鲁氏酵母中表现出更高的遗传稳定性,获得了具有更好的复制起始效率和遗传稳定性的ARS-G3,具有更好的遗传稳定性的CENE,稳定性良好的质粒pUC19-Nrs-ARS-B2-CENE,其对于后续在鲁氏酵母内建立一套稳定的基因编辑系统具有重要意义。


首先用由生物信息学方法分析预测得到的鲁氏酵母源ARS和CEN元件构建不同的着丝粒型游离质粒;其次通过电穿孔转化法将上述质粒转入鲁氏酵母MQ1中;最后测定相应重组菌株的生长曲线和质粒丢失率,结果表明具有鲁氏酵母源ARS和CEN元件的质粒转入鲁氏酵母中表现出更高的遗传稳定性。其中ARS-G3具有更好的复制起始效率和遗传稳定性,CENE具有更好的遗传稳定性,质粒pUC19-Nrs-ARS-B2-CENE稳定性良好。


为了考察不同ARS序列和CEN序列对游离型质粒的遗传稳定性的影响,以重组菌株MQ1-41Nrs(酿酒酵母源ARS)作为对照,对重组菌株MQ1-B2-A、MQ1-A1-A、MQ1-C4-A、MQ1-C7-A、MQ1-G1-A、MQ1-G2-A、MQ1-G3-A以及重组菌株MQ1-B2-A、MQ1-B2-B、MQ1-B2-C、MQ1-B2-D、MQ1-B2-E、MQ1-B2-G、MQ1-G3-E的生长曲线和质粒丢失率进行了测定。

生长曲线的测定


将鲁氏酵母重组菌株接种于添加适量抗生素的5mL YPD液体培养基内,并置于30℃,250rpm条件下培养24h,次日将初始OD600值调整为0.2转接一次,在相同条件下培养8h左右至对数期。使用无菌水洗涤两遍菌体后,利用添加适量抗生素的YPD液体培养基,调整菌株初始OD600值为0.2,吸取300μL菌液转移至全透明的100孔深孔板中,采用全自动生长曲线测定仪测定菌株的菌浓,培养温度设定为30℃,每隔1h机器自动记录一次数据,直至OD600值趋于稳定不变时结束测定,以此数据绘制生长曲线。

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