1.3.7 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌细胞壁完整性的影响
取1.3.2节所得菌悬液500μL至2 mL离心管中,再取质量浓度分别为1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代谢物溶液500μL加到离心管中,使代谢物终质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以无菌去离子水替代代谢物作为对照,每个浓度3个管,于28℃培养4 h。5 000 r/min,4℃离心10 min,取上清液。参考AKP试剂盒步骤进行操作,测定上清液中AKP活力。
1.3.8 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌细胞膜完整性的影响
参照苏晓丹[18]的PI染色法并稍作修改。取1.3.2节所得菌悬液500μL至2 mL离心管中,再取浓度分别为1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代谢物溶液500μL加到上述离心管中,使代谢物终质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以无菌去离子水替代代谢物作为对照,每个浓度3个管,于28℃培养4 h。将培养好的菌液以5 000 r/min,4℃离心10 min,弃上清液,所得菌体用PBS重悬洗涤2次后,离心弃上清液,PBS重悬,加入PI染料(终质量浓度为10μg/mL),4℃避光孵育30 min,PBS重悬洗涤2次,离心弃上清液,PBS重悬,取菌悬液10μL在荧光显微镜下观察。激发波长为535 nm,发射波长为615 nm。
1.3.9 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌细胞形态的影响
取1.3.2节所得菌悬液20 mL于50 mL离心管中,再取浓度分别为1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代谢物溶液20 mL加到上述管中,使代谢物终质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以无菌去离子水替代代谢物作为对照,于28℃培养10 h。将培养好的菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清液,所得到的菌体用PBS重悬洗涤2次后,将菌体悬浮于2.5%戊二醛-PBS溶液固定(4℃)。过夜后用PBS洗涤菌体3次,后置于1%锇酸中固定30 min,随后用不同浓度的乙醇梯度洗脱。最后将样品滴加至专用玻片并贴附于场发射扫描电镜载物台,用临界点干燥仪干燥8 h后镀金,使用场发射扫描电子显微镜(field-emission scanning electron microscope,FESEM)观测细菌细胞形态。
1.3.10数据统计分析
采用Origin 2022软件(OriginLab Corporation,USA)进行绘图,SPSS Statistics 26.0(IBM Corp.,USA)对数据进行ANOVA分析或t检验,实验重复3次,取测定结果的平均值,数据用平均值±标准误差表示。
2结果与分析
2.1 SCB2505代谢物MIC的测定
由表1可知,对于液化沙雷氏菌SCB2649菌株,植物乳杆菌SCB2505代谢物质量浓度为4 mg/mL时,液体培养基浑浊,指示菌液化沙雷氏菌SCB2649菌株有明显的生长现象发生,但质量浓度为8 mg/mL的试管中液体清澈,指示菌SCB2649菌株无明显的生长现象,因此植物乳杆菌SCB2505代谢物对该指示菌的MIC可确定为8 mg/mL。
表1 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌最小抑菌浓度
注:“+”代表浑浊;“-”代表澄清。
2.2 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌生长曲线的影响
由图1可知,对照组的液化沙雷氏菌SCB2649菌株在24 h内快速增长,在24 h时OD600nm值为0.912。加入植物乳杆菌SCB2505代谢物浓度为0.5 MIC时,液化沙雷氏菌SCB2649菌株生长受到明显的抑制作用,相同时间的OD值明显低于对照组。加入代谢物浓度达到1.0 MIC时,液化沙雷氏菌SCB2649菌株生长完全被抑制,24 h内其OD600nm值没有变化。说明植物乳杆菌SCB2505代谢物浓度达到1.0 MIC时,在液体培养时也能够有效抑制液化沙雷氏菌SCB2649菌株生长繁殖。
图1 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株生长的影响
2.3 SCB2505代谢物抑菌成分分析
2.3.1热稳定性
如表2所示,经70℃处理20 min后,SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株的抑菌效果与对照组相比无显著差异(P>0.05),而100℃和121℃处理后的代谢物抑菌效果显著下降(P<0.05),但相对抑菌活性仍有90%左右保留。说明植物乳杆菌SCB2505代谢物中抑菌活性物质具有较好的耐热性,但可能其中有部分抑菌物质对热较为敏感。
表2高温处理对SCB2505代谢物抑菌活性的影响
注:采用t检验分析实验组及对照组抑菌圈直径的显著性差异(P<0.05),以*表示。
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