摘要豆科作物根瘤菌被噬菌体浸染后，在一定程度上会引起根瘤菌数目和结瘤量的降低，进而导致共生固氮作用弱化和作物产量的显著下降。然而，目前关于根瘤菌噬菌体的相关研究报道较少。本研究以3株模式根瘤菌，即慢生型大豆根瘤菌、中华大豆根瘤菌和中华苜蓿根瘤菌为宿主，于黑土农田土壤中采用双层平板培养法从每个宿主细菌分离3株噬菌体，共分离获得9株根瘤菌噬菌体，对其形态结构及生物学特征进行综合分析。结果表明：侵染苜蓿根瘤菌噬菌体（SMM）和慢生型根瘤菌噬菌体（BDM）属于肌尾噬菌体科，而侵染中华根瘤菌噬菌体（SSS）隶属于长尾噬菌体科。9株噬菌体的最佳感染复数均在0.001——1.0的变化范围内。一步生长曲线结果显示，BDM的潜伏期和爆发期明显长于SMM和SSS，但获得的裂解量最小。根瘤菌噬菌体在30——40℃和中性pH条件下侵染活性最大。对比发现，侵染同一宿主的噬菌体生物学特征虽存在一定差异，但分异度远小于不同宿主噬菌体间的差异。
根瘤菌（rhizobia）可以侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养，是一类与农业生产关系密切的革兰氏阴性细菌。目前随着根瘤菌分类系统的不断补充和完善，以表型和遗传型分类为基础，根瘤菌科已发展到7属36种，其主要来源于变形菌门（Proteobacteria）中的“Alpha”和“Beta”变形菌亚门。随着根瘤菌基因组测序研究的不断发展，我国学者对26株中华根瘤菌属（Sinorhizobium）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizo-bium）两属代表菌株进行比较基因组学分析，研究成果推动了根瘤菌基因组学的发展。根瘤菌对农业生产至关重要，但根瘤菌噬菌体（rhizobiophages）广泛存在于土壤、根围和根瘤中，被认为是影响土壤根瘤菌组成、种群数量以及结瘤固氮的主要生物因素。由于噬菌体生态学和基因组学研究的相对滞后，关于根瘤菌噬菌体的相关研究目前还报道较少
细菌病毒也称噬菌体，是一类感染细菌、古菌等原核微生物病毒的总称。噬菌体在自然生态系统中广泛存在，其不仅是地球上最大的遗传基因库，而且在控制其宿主群落演替、遗传基因的水平移动，以及生物进化中起到重要的桥梁作用。根瘤菌噬菌体可以侵染根瘤菌并且会导致其退化甚至死亡，有研究发现，噬菌体侵染根瘤菌后会显著降低根瘤菌数目和结瘤量，进而导致固氮作用和作物产量呈显著降低的趋势。噬菌体可以通过减少土壤中易结瘤菌株种群密度来影响豆科植物与根瘤菌之间的共生关系。噬菌体侵染根瘤菌后，导致根瘤菌在基因水平上发生变异，使其丧失固氮功能，导致有效根瘤菌数量及种类的降低，继而降低根瘤菌的共生固氮作用。因此，以目标根瘤菌株为诱饵，对分离获得的根瘤菌噬菌体研究有助于了解不同根瘤菌属共生固氮体系的退化机制。
鉴于此，本研究以慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhi-zobium diazoefficiens USDA110T）、中华大豆根瘤菌（Sinorhizobium sojae CCBAU05684T）和中华苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti USDA1002T）3株模式菌株为宿主，从土壤中分离获得不同根瘤菌宿主的噬菌体株，对其形态特征、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线及对温度、pH和紫外光稳定性等指标进行分析，旨在明晰噬菌体与根瘤菌间的侵染关系，了解根瘤菌噬菌体的生物学特征，为根瘤菌噬菌体生态学的发展奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌株和病毒溶液
供试菌株为中国农业大学农业部农业微生物资源及其应用重点开放实验室提供的3株不同类型的模式根瘤菌株，其中包括慢生型大豆根瘤菌、中华大豆根瘤菌和中华苜蓿根瘤菌。土样样本采集于中国科学院东北地理与农业生态研究所试验田（45°41′N,126°38′E）。取采集的新鲜土样5g,放入装有10mLYMA （KH2PO40.25g,K2HPO40.25g,MgSO4·7H2O0.20g,pH7.0）液体培养基的三角瓶中，200r·min——1摇床振荡过夜培养。混合液12000´g离心15min,上清液采用0.22μm滤膜进行过滤，收集获得的过滤液即为土壤病毒溶液。
1.2研究方法
1.2.1噬菌体的分离与纯化参照Nakayama等方法进行噬菌体的侵染与分离。取1mL过滤后土壤悬液与0.2mL宿主菌液（对数生长期）混合后，加入5mLYMA液体培养基中振荡培养48h.培养液12000xg4℃离心10min,上清液经0.22μm滤膜过滤，获得噬菌体原液。取1mL噬菌体原液与0.2mL生长至对数生长期的宿主菌悬液混合，孵育15min后，加入6mL冷却至47℃的YMA半固体培养基，倒入预先准备已凝固的YMA固体培养基平板，制成双层平板。室温放置30min左右，倒置放入28℃恒温培养箱中，培养观察双层平板出现噬菌斑后，即获得以相应根瘤菌为宿主的噬菌体株。
采用重复挑取单个噬菌斑、连续与目标根瘤菌宿主悬液共培养的方法，进行根瘤菌噬菌体的纯化即挑取单个较大的、边缘光滑的噬菌斑放入装有1 mL SM缓冲液（0.1 mol·L-1 NaCl,8 mmol·L-1 MgSO4·7H2O,50 mmol·L-1 Tris-HCl,0.005%（W·V-1）甘油，pH 7.0）的离心管中，4℃静止保存12h后，12000xg4℃离心10min,取0.1mL上清液做连续10倍稀释，分别取1mL稀释液与0.2mL对数生长期的菌液（OD600≈0.5）混匀后，制成双层平板重新获得噬菌斑，连续重复上述步骤4——5次后，即可获得纯化的根瘤菌噬菌体株。