猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床特征的急性、高度接触性肠道传染病，对全球养猪业造成严重经济损失。为掌握河南省当前PEDV流行毒株的遗传变异趋势、病毒生物学特性，并为新型高效疫苗的研发提供科学依据，本研究于2020年至2021年底在河南省范围内采集499份仔猪腹泻病料，开展分子流行病学调查、病毒分离鉴定、全基因组测序分析、病毒体外复制动态（生长曲线）测定及灭活疫苗的研制与免疫效果评价。
结果显示，499份样品中PEDV阳性162份，阳性率为35.2%。对其中21株流行毒株S基因测序分析表明，其核苷酸同源性为96.9%～100%，氨基酸同源性为95.2%～100%，均属于GIIb进化群，且S蛋白存在7处规律性新突变。成功分离获得两株强毒株CHHNKF03和CHHNPDS01，全基因组分析显示其与国内近年流行毒株核苷酸同源性为95.6%～98.7%，亦归属GIIb群。病毒体外复制动态测定（生长曲线）显示，CHHNKF03株在感染后24小时达到病毒滴度峰值（10⁶.⁰TCID₅₀/0.1 mL），而CHHNPDS01株在30小时达峰（10⁵.⁸TCID₅₀/0.1 mL），提示两株病毒复制动力学存在差异。基于CHHNKF03株研制的灭活疫苗经优化培养条件（MOI=0.01，收毒时间24 h）、灭活工艺及Freemix水性佐剂筛选后，免疫妊娠母猪可诱导良好免疫应答，仔猪攻毒保护试验显示免疫组保护率达80%，显著高于商品化疫苗组（60%）和对照组（20%）。本研究系统揭示了河南地区PEDV流行毒株的遗传演化特征与体外复制规律，为PEDV的精准防控及新型疫苗研发提供了重要理论与实践基础。
1.引言
猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，自2010年以来在我国广泛流行，尤其是GII型变异毒株的出现导致原有疫苗保护效果下降，疫情反复爆发。河南省作为我国生猪养殖大省，PED疫情形势严峻。为应对病毒持续变异带来的防控挑战，亟需掌握本地流行毒株的遗传特征、复制能力及致病性，并基于当前流行株开发高效疫苗。
本研究聚焦河南省PEDV流行现状，通过分子流行病学调查明确流行率，分离鉴定代表性毒株，重点分析其体外复制动态（生长曲线），并基于分离株开展灭活疫苗研制与免疫效果评估，旨在为PED的科学防控提供数据支持和技术储备。
2.材料与方法
2.1实验设计流程
实验流程主要包括三个阶段：
1.分子流行病学调查：采集腹泻病料→RNA提取→RTPCR检测→S基因测序与遗传进化分析；
2.病毒分离鉴定与全基因组测序：PEDV阳性样品接种Vero细胞盲传→CPE观察→RTPCR与IFA鉴定→透射电镜观察→病毒滴度测定与生长曲线构建→全基因组测序与进化分析→仔猪回归试验验证致病性；
3.灭活疫苗研制与免疫评价：优化病毒培养条件→灭活工艺验证→佐剂筛选→妊娠母猪免疫→仔猪攻毒保护试验。
2.2分子流行病学调查
采集2020–2021年河南省499份仔猪腹泻病料，提取RNA后采用RTPCR扩增PEDV N基因进行筛查。阳性样品进一步扩增S基因并测序，选取21株进行同源性比对与系统发育分析。
2.3病毒分离与鉴定
将RTPCR阳性病料接种于Vero细胞，连续盲传至出现典型细胞病变效应（CPE），包括细胞圆缩、聚集、融合形成合胞体等。收获病毒液后进行RTPCR和间接免疫荧光（IFA）鉴定，并通过透射电镜观察病毒形态。
2.4病毒滴度测定与生长曲线构建（重点）
2.4.1 TCID₅₀测定
采用ReedMuench法测定病毒半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）。将分离株CHHNKF03和CHHNPDS01进行10倍系列稀释，接种6孔板Vero细胞，每孔0.1 mL，设8个重复，37℃培养5天，观察CPE。计算结果显示：
CHHNKF03株TCID₅₀=10⁵.⁵/0.1 mL
CHHNPDS01株TCID₅₀=10⁵.⁰/0.1 mL
2.4.2病毒体外复制动态测定（生长曲线）
为明确两株病毒的复制动力学特征，进行生长曲线测定：
将CHHNKF03和CHHNPDS01株以MOI=0.01接种Vero细胞（6孔板）；
分别于感染后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h收集病毒液（含上清与细胞）；
每时间点做3个重复，冻融3次后测定病毒滴度（TCID₅₀/0.1 mL）；
绘制病毒滴度随时间变化的生长曲线。
2.4.3不同感染复数（MOI）与收毒时间优化
为后续疫苗生产优化工艺，进一步研究CHHNKF03株在不同MOI（0.002、0.006、0.01、0.03、0.1）下的复制动态，于感染后6–36 h每隔6 h收毒测滴度。
2.5全基因组测序与遗传进化分析
提取病毒RNA，通过RTPCR扩增全基因组并测序。利用MEGA软件进行核苷酸同源性比对和系统发育树构建，参考GenBank中52株国内2011–2019年流行毒株序列。
2.6灭活疫苗研制
病毒培养条件优化：比较不同MOI与收毒时间对病毒产量的影响；
灭活工艺：采用BEI（2溴乙基异氰酸酯）或甲醛灭活，验证灭活彻底性；
佐剂筛选：测试Freemix、油佐剂、铝胶等不同佐剂配苗后的免疫效果；
免疫程序：妊娠母猪产前40天和20天各免疫一次，每次2 mL；
攻毒保护试验：仔猪出生后7日龄口服强毒攻击，观察临床症状与死亡情况，计算保护率。