[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗，利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒，将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81)，通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化，以重组病毒感染F81细胞连续10 代验证其遗传稳定性，通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP; 提取重组病毒DNA，通过PCR验证gIgE基因无目的条带，表明重组病毒纯化成功，再通过PCR验证RFP基因有目的条带，表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示，与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%; 在F1—F10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象，表明重组病毒可稳定表达外源基因; 测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线，重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性; 噬斑观察及染色结果显示，在病毒感染细胞前、后期，重组病毒的噬斑都小于亲本病毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。
引言
猫疱疹病毒Ⅰ型(feline herpesvirusⅠ,FHV-1)属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科,自1958年分离得到以来被认为是最具临床意义的可以引起猫呼吸系统疾病的病原体,也是引起猫眼部疾病的重要原因。临床上导致幼猫罹患病毒性呼吸系统疾病的病原因子中约50%都是由于感染了FHV-1的缘故。FHV-1感染后的潜伏期一般为2～6 d,所致的典型临床症状为猫眼鼻处出现大量浆液性分泌物,患猫精神沉郁、食欲不振、打喷嚏,眼部症状严重时还会引发角膜出现溃疡。感染FHV-1后很难彻底根治,原因是病毒可潜伏于三叉神经节中造成终生带毒。当猫免疫力低下或者处于应激状态时,潜伏于三叉神经的病毒可快速复制并造成多次感染,且可间歇性通过眼鼻进行排毒。因此临床上所有康复的猫均有可能是带毒动物,成为其他健康猫的传染源。检测FHV-1血清和抗体呈阳性的猫占猫群的50%～75%。由于疱疹病毒的潜伏特性,因此开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的疫苗十分必要。目前,针对FHV-1的疫苗大多数是与猫杯状病毒、猫瘟病毒联合使用的多联苗,但这些疫苗只能减轻临床症状,并不能阻止病毒的脱落以及潜伏。
FHV-1基因组中有很多关键毒力基因,如胸苷激酶(TK)基因。TK缺失后不仅可以实现病毒的毒力下降,理论上还可以在缺失位点插入其他外源基因以改造病毒基因组,而这种致弱活疫苗载体甚至可以成为针对FHV-1的弱毒疫苗平台。位于FHV-1基因组US区的gIgE基因也是其主要的毒力基因。当gI或gE基因单独表达时,很难在细胞表面检测到基因表达产物; 当两者共表达时,其转录复合物从内质网中运输并在细胞表面表达。这说明gI和gE需相互协作才能更好表达。糖蛋白gIgE在疱疹病毒家族中高度保守,属于非必需糖蛋白。这类糖蛋白对于病毒生长复制来说不是必需的,但缺失后能明显改变病毒毒力。在伪狂犬病毒(PRV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒(HSV-1)以及猫疱疹病毒(FHV-1)中,gI和gE糖蛋白是形成合胞体以及感染正常细胞所必需的磷酸蛋白,也是病毒感染宿主神经系统的主要毒力基因。有研究表明,与野毒相比,接种gI或gE基因缺失株的动物几乎未在中枢神经系统中分离出病毒,而中枢神经系统感染是导致潜伏期建立的重要原因。鉴于此,本试验拟利用同源重组及CRISPR/Cas9技术,将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP),分析其体外生长特性,为开发基于FHV-1弱毒疫苗载体以及相关多联疫苗提供理论基础。
相关新闻推荐
1、老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（一）