摘要:试验旨在筛选优质土壤源益生菌菌种资源，为畜牧生产中微生态制剂研发提供候选菌株。试验以北京市郊区农田土壤为材料，经紫外诱变、革兰氏染色和接触酶试验分离并筛选出1株对金黄色葡萄球菌具有明显抑制能力的菌株。通过16S rRNA基因进化分析和种属鉴定，判定该菌为一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。进一步通过耐热、耐酸、耐胆盐和抗生素敏感性检测，发现该地衣芽孢杆菌在85℃处理10 min后存活率高达93.33%，pH为3.0及2.5时对其活性均影响较小，并且在0.3%、1.0%和2.0%的胆盐浓度下培养3h仍可继续生长，表现出优良的抗逆性。通过与病原菌混合培养以及对多种致病菌的抑菌试验检测，发现该菌株对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抑制作用。
我国是猪的养殖和消费大国，猪肉是人民肉类膳食结构的重要组成部分。据农业农村部数据显示，在经历了非洲猪瘟及新型冠状病毒肺炎疫情的考验后，2020年全国生猪生产基本恢复，规模化率达到57%。然而，随着养殖规模化集约化水平不断提升，动物与自然环境(土壤等)的接触受到极大限制，导致动物正常消化道微生物区系建立发生障碍。特别是在仔猪断奶阶段，在外界环境条件发生变化时，易引起动物消化道微生态失衡，从而降低了仔猪对病原菌的抵抗能力，引起动物机体细菌性腹泻，影响生产性能。长期以来，抗生素在改善畜禽生长性能和疾病防治方面发挥重要作用，但养殖业滥用抗生素现象十分普遍，导致细菌耐药性增强、耐药菌株扩散和抗生素残留等一系列问题，严重威胁养殖业健康发展和人类健康。因此，开发新型抗生素替代品已是当前饲料添加剂领域的研究热点。
芽孢杆菌有广谱抑菌活性，能产生丰富的代谢活性物质，具有良好的益生作用。耐高温、耐酸，且方便保存，是当前应用广泛的一种益生菌。地衣芽孢杆菌对病原微生物有抑制和拮抗作用，对体内有益菌则有促生长作用，能够调整与治疗菌群失调，还可通过夺氧生物效应使肠道缺氧，利于大量有益健康的厌氧菌生长，通过此种双重作用可以维持机体肠道微生态平衡，进而预防和治疗肠道疾病。由于不同菌株间具有特性差异，且其生长特性、制备工艺、生物学活性以及在畜禽中的作用效果会因发酵原料及应用对象不同而产生很大差异。目前虽已有较多芽孢杆菌制剂应用于饲料中，但源于环境土壤的地衣芽孢杆菌益生菌菌株却鲜见报道。因此，筛选出能明显抑制常见致病菌且抗逆性强的芽孢杆菌具有较大的研究和开发前景。本研究以土壤为材料分离并筛选地衣芽孢杆菌，研究其生理生化特性和益生性能，为益生菌在畜禽中的应用提供菌种。
1材料与方法
糖20g，吐温80 1 mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨2g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，酵母粉4g，用蒸馏水定容至1000mL。
MRS琼脂培养基:1L MRS肉汤培养基中加琼脂15 g。
麦康凯培养基:月示胨胨3g，猪胆盐5g，中性红0.025g，蛋白胨胨17g，乳糖10g，结晶紫0.001g，氯化钠5g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL。
M17培养基:大豆蛋白胨胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，酪蛋白胨胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，MgSO4·7H2O0.25g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL。
糖醇发酵培养基:蛋白胨胨5g，牛肉粉5g，酵母膏5g，吐温80 0.5 mL，糖或醇类10g，琼脂5g，蒸馏水1 000mL，加上1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL。
乳糖测定培养基:乳糖10g，酵母膏1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
LB液体培养基:蛋白胨胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，用蒸馏水定容至1000mL。
LB固体培养基:1L LB培养基中加琼脂15g。
1.2菌株的分离与纯化
取1g土样放于装有9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀。取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1 mL涂布于含有10mg/kg放线菌酮的MRS琼脂培养基及M17琼脂培养基中，37℃厌氧培养48~72h，观察并记录菌落形态。挑取长势良好的特征单菌落于MRS液体培养基中，进行划线分离纯化。观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4℃冰箱贮藏备用。
将长势良好的特征单菌进行紫外诱变，涂布于LB平板上，每平皿控制菌落在30~50个，在37℃下恒温培养。在刚产生针尖样菌落时，用内径6mm的打孔器连同下方琼脂一同取出，转移至无菌空白平皿内。在37℃下继续培养24h后，涂布于有金黄色葡萄球菌的平皿上，筛选出抑制能力强的诱变菌株进行后续试验。
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