1.2.4噬菌体形态观察
参考《分子克隆实验指南》中关于噬菌体颗粒的PEG/NaCl沉淀提取法进行噬菌体纯化颗粒制备，噬菌体颗粒溶于SM缓冲液中，4℃保存备用；用负染色法对噬菌体颗粒进行染色，取20μL噬菌体颗粒与20μL浓度为0.5%的戊二醛混合，滴在铜网上静置15 min，使噬菌体颗粒固定。用2%的磷钨酸对噬菌体颗粒进行负染色1-2 min，用滤纸吸干多余液体，用透射电镜在80 kV电压下观察。拍照并储存。
1.2.5噬菌体最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）测定
将培养至对数期，OD600nm≈0.2，菌液浓度约为1×109 CFU/mL的宿主菌液，与已知滴度的噬菌体液（2×109 CFU/mL）倍比稀释，按照噬菌体滴度与宿主菌浓度的比值分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1的比例混匀，37℃，160 r/min培养4 h，取出后用0.45μm滤器过滤，滤液倍比稀释后测定各体系下的噬菌体滴度，滴度最高的体系的比值即噬菌体的最佳感染复数，重复3次。
1.2.6噬菌体一步生长曲线及爆发量测定
取最佳MOI对应的宿主菌液和噬菌体液各500μL，放入培养箱，37℃培养10 min，将混合液8 000 r/min离心30 s，吸弃上清液，然后加入1 mL NB吹打使沉淀重悬，重复两次。在锥形瓶中加入此悬液，再加19 mL营养肉汤，放入摇床，37℃，160 r/min，开始每5 min取样1 mL，30 min后，每10 min取样1 mL，至100 min停止取样。每次取样都需用0.45μm滤器过滤，然后暂时放入4℃保存，待全部取样完成后，统一取出进行倍比稀释，测定噬菌体滴度，重复3次。
1.2.7噬菌体的热稳定性和pH稳定性试验
（1）噬菌体热稳定性。将噬菌体液分成4组，每组6 mL，分别放入50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中，每隔10 min取1 mL噬菌体液稀释10倍，防止高温影响实验结果，暂时放入4℃保存，待全部取样完成后，统一取出进行倍比稀释，测定噬菌体滴度，重复3次。
（2）噬菌体pH稳定性。取1 mL的噬菌体液加入9 mL不同pH（1-14）的营养肉汤中，37℃恒温培养1 h，取出后进行倍比稀释，用上文的方法测定噬菌体滴度，重复3次。
1.2.8噬菌体宿主范围测定
将实验室保存的其他大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌全部复苏并培养至对数期，取500μL菌液加入小试管中，再加入5 mL半固体培养基（50℃左右），混匀后使半固体培养基平铺在琼脂平板上，凝固后在中心处滴加2-3滴噬菌体液，晾干后37℃倒置培养过夜。次日观察各个平板中心是否出现噬菌斑。
1.2.9噬菌体DK-13全基因组测序及分析
按1.2.4方法获得的500μL噬菌体浓缩液，加入2.5μL DNase I（1 mg/mL）和0.5μL RNase A（1 mg/mL），之后加入25μL EDTA，25μL蛋白酶K和20μL SDS，56℃水浴1 h,裂解噬菌体。随后使用苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）提取噬菌体DNA，送至杭州联川生物技术股份有限公司进行全基因组测序。使用在线软件tRNAscan-SE预测噬菌体中是否含有tRNA;CG view展示序列中GC skew-和GC skew+等特性情况的圆形基因图。
使用ORFs Finder预测噬菌体DK-13的开放阅读框（ORF）；使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）预测并注释每个开放阅读框的功能；使用VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）数据预测噬菌体DK-13是否含有毒力基因；使用CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）数据库检索预测噬菌体DK-13是否含有耐药基因。
选取噬菌体DK-13的保守基因DNA连接酶进行BLASTP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），寻找同源性蛋白，再使用MEGA6（https://www.megasoftware.net/）软件邻域连接构建噬菌体DNA连接酶的系统发育进化树进行进化关系分析。
1.2.10细菌污染猪肉模型制备及不同温度下噬菌体DK-13对污染猪肉的杀菌效果
将从超市购买的猪里脊肉部分用无菌刀片切成边长约为2 cm的正方形薄片，用1 mL PBS缓冲液冲洗，紫外灭菌2 h，使肉片充分灭菌。滴加100μL浓度为1×107 CFU/mL的宿主菌液滴在肉片表面，使其充分接触，静置10 min，得到浓度为1×106 CFU/sample的EIEC污染的猪肉样品，放入4℃冰箱保存。
取最佳感染复数的宿主菌液的噬菌体液滴在猪肉样品表面，使其与样品充分接触进行杀菌，对照组则滴加等体积的PBS缓冲液，分别放入4℃冰箱和37℃恒温培养箱培养6 h。每隔1 h取样一次，加入装有PBS缓冲液的离心管中，充分震荡后在相应温度下，5 000 r/min离心1 min，吸弃上清后再加1 mL PBS缓冲液，重悬后在相应温度下5 000 r/min离心1 min，重复两次。将最后一次悬液梯度稀释，取100μL菌液均匀涂布在平板上，37℃倒置培养过夜。次日对平板上菌落进行计数。重复3次。
2结果
2.1噬菌体的分离及其滴度测定
从医院未经处理的污水中分离出了一株烈性噬菌体，命名为DK-13，采用双层平板法纯化后，得到了纯化后的单一噬菌体，噬菌体DK-13的噬菌斑为圆形，透明且无晕环，直径约为1-2 mm。结果如图1-A所示。
图1噬菌体DK-13的形态特征
A:噬菌体形态；B:透射电镜形态
通过计算可以得出噬菌体DK-13的滴度约为2×109 PFU/mL。
2.2噬菌体形态学观察
如图1-B所示，噬菌体DK-13呈典型的蝌蚪状外形，包含一个直径约为100 nm的正二十面体的头部和一个可收缩的螺旋对称的尾部，根据ICTVdb数据库的规则分类，噬菌体DK-13属于有尾噬菌体目（Caudovirales）肌尾噬菌体科（Myoviridae）T4噬菌体亚科（Tevenvirinae）噬菌体。
2.3噬菌体最佳感染复数的测定
噬菌体DK-13与宿主菌EIEC的感染复数为0.01时，产生子代噬菌体的数量最多，效价为2.8×1010 PFU/mL,说明噬菌体DK-13的最佳感染复数为0.01（图2-A）。
图2噬菌体DK-13的生物学特性
A:噬菌体DK-13的MOI；B:噬菌体DK-13的一步生长曲线。不同小写字母表示处理组别间有显著差异（P<0.05)。下同
2.4噬菌体一步生长曲线及爆发量的测定
取最佳感染复数0.01对应的宿主菌液和噬菌体液各500μL，测定不同时间噬菌体的滴度。以时间为横轴，噬菌体滴度的对数为纵轴，绘制一部生长曲线。结果如图2-B所示，噬菌体DK-13的潜伏期约为10 min，裂解期约为70 min，平均爆发量为164 PFU/cell。
2.5噬菌体稳定性的测定
2.5.1噬菌体在不同温度下的稳定性
本试验测试了噬菌体DK-13在50℃、60℃、70℃和80℃的条件下，1 h之内的活性情况。结果如图3-A所示，在50℃和60℃时，噬菌体的活性几乎不发生变化；70℃下噬菌体活性下降，20 min后完全失活；温度升高至80℃，噬菌体10 min后完全失活。结果表明噬菌体DK-13受温度影响较小。
图3噬菌体DK-13的生物学特性
A:噬菌体DK-13的热稳定性；B:噬菌体DK-13的酸碱稳定性
2.5.2噬菌体在不同pH下的稳定性
噬菌体DK-13在pH 1-14的环境下，1 h之内的存活情况测试结果如图3-B所示：在pH 5-10的条件下，对噬菌体DK-13的活性并没有很大的影响，噬菌体均体现了较高的活性；在pH 4或pH 11的条件下，噬菌体的活性略有下降，但依然有大量噬菌体存活；在pH<4或pH>11的条件下，几乎检测不到存活的噬菌体。
2.6噬菌体宿主范围的测定
将实验室保存的其他15株大肠埃希菌，2株蜡样芽孢杆菌，3株金黄色葡萄球菌全部复苏并培养至对数期，用噬菌体DK-13进行裂解测定，结果显示噬菌体DK-13不能裂解以上任何细菌，只能裂解宿主菌EIEC。说明噬菌体DK-13的特异性非常强。详细结果见表1。
表1噬菌体DK-13宿主范围
2.7噬菌体全基因组分析
测序结果显示：噬菌体DK-13基因组全长172 275 bp，GC含量为40.18%。tRNAscan-SE分析结果显示：噬菌体DK-13基因组中含有tRNAMet、tRNAArg。噬菌体DK-13的全基因组信息已上传至GenBank，登录号为MT611523。