摘要：在木质纤维素原料预处理过程中不可避免地形成抑制剂，包括糖降解产物(如5-羟甲基糠醛、糠醛)以及木质素降解的酚类化合物(如4-羟基苯甲酸、香兰素)等，这些化合物会降低发酵效率。[目的]提高酵母对纤维素水解液中的抑制物耐受性对工业生物质乙醇高效生产至关重要。[方法]采用浓度较高的糠醛和对羟基苯甲酸对模式菌株W303-1A进行梯度驯化，对比驯化菌株和出发菌株在不同抑制物浓度下的生长曲线及发酵乙醇性能；对驯化后菌株和出发菌株进行高通量基因组重测序，分析其糖代谢途径和耐药性相关的变异点基因，对与耐抑制物有关的变异点进行分析挖掘。[结果]在含有2.0 g/L糠醛的培养基中，F-2菌的乙醇产量为19.40 g/L，比原始菌株高2倍。在含有1.6 g/L糠醛和对羟基苯甲酸的培养基中，B-2菌的最高乙醇产量为20.22 g/L，是原始菌株的7.6倍。通过对出发菌株和驯化后菌株进行高通量基因组重测序发现，糖代谢途径中编码乙醇脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和丙酮酸脱氢酶的基因发生部分突变，而YAP1(参与氧化应激反应和氧化还原稳态的转录激活剂)、PDR5(耐多种化学物质的多效ABC外运载体)和RPN4(锌指蛋白)基因的部分突变对酿酒酵母的耐抑制物具有重要作用。[结论]研究结果为进一步优化和构建模式菌株提供更多的操作靶点。
过度使用石油等化石燃料带来的储量枯竭、温室气体排放等问题危害着能源安全和生态环境。近年来，生物质燃料凭借其原料廉价、来源丰富且可再生性等受到了广泛关注，成为替代能源的新选择。木质纤维素燃料乙醇是二代生物质能源，包括农林废弃物、工业废残留物、餐厨垃圾等，可以缓解粮食危机。利用木质纤维素生产乙醇要经过预处理过程，然而在此过程中会产生一些抑制物，严重影响微生物生长和乙醇得率。抑制物的种类和含量因原料和预处理方法的不同存在差异，主要分为酚类化合物(香草醛、丁香醛、苯酚等)、酸类化合物(乙酸、甲酸等)和呋喃醛类化合物(糠醛、5-羟甲基糠醛)三大类。其中酚类化合物在纤维素水解液中的含量很低，但其毒性却很大，且一些低分子含有脂肪族官能团的酚类化合物的抑制效果最强。为了降低抑制剂的抑制作用，通常会选择在发酵前脱毒处理，然而此过程复杂，工业成本较高，并且会造成糖分的损失，经济效益不高。因此，选育抑制物高耐受性的微生物更加经济有效。
酿酒酵母是传统乙醇生产工业中使用的微生物，发酵效率高并且对一些毒性物质耐受性较强，因此进一步选育抑制物高抗性的酿酒酵母对提高纤维素乙醇生产效率具有重要意义。目前，选育酿酒酵母主要利用诱变筛选、定向梯度驯化、基因工程等手段。诱变筛选是一种简单的传统选育方法，会产生多种突变，具有较强的随机性。基因工程手段是基于基因组、转录组和蛋白组分析，挖掘靶点基因，设计出合理的基因改造策略和路线，有针对性地强化菌株对抑制剂的耐受性。定向梯度驯化则通过施加外界环境压力筛选获得高耐受力菌株，是自然选择理想表型性状突变菌株的有力方法，广泛应用于产生耐抑制剂的酵母菌株。虽然已获得多种耐受单一抑制剂的工程菌株，并揭示了其耐受机理，但实际水解液的复合抑制剂作用复杂，包括累加作用和协同作用，其作用机制尚不明了。
本研究选取糠醛和对羟基苯甲酸作为环境压力，对酿酒酵母W303-1A进行单一抑制物和复合抑制物的定向梯度驯化。得到的耐受菌株在不同抑制物种类和浓度的培养基中验证其生长和发酵性能，并通过高通量重测序分析基因差异，以期找到新的靶点基因，阐明酿酒酵母对糠醛、对羟基苯甲酸的代谢通路，揭示其耐受机制。
1材料与方法
1.1样品
本研究所用的酿酒酵母菌株为模式菌株W303-1A，购自广州星禾科技生物有限公司，活化后的甘油菌平板划线培养，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中振荡培养12−16 h备用。
1.2培养基
YPD活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0 g，酵母浸粉10.0。121℃灭菌15 min后备用(固体培养基则另添加2%琼脂粉)。
YPD驯化培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母浸粉10.0。121℃灭菌15 min后备用。分别加入不同剂量过滤除菌的抑制物，抑制物为糠醛或对羟基苯甲酸。
YPD发酵培养基(g/L)：葡萄糖50.0，蛋白胨20.0，酵母浸粉10.0。121℃灭菌15 min后备用(可加入不同浓度的抑制物制成检测培养基)。
1.3主要试剂
葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糠醛购自广州化学试剂厂；对羟基苯甲酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司。