1.5碱性磷酸酶(AKP)活性测定
测定不同浓度没食子酸溶液在不同时间对溶藻弧菌细胞壁的影响。取对数生长期的溶藻弧菌5 000 r/min离心5 min，用PBS重悬配制成1×10⁶CFU/mL的菌悬液。实验组为在10 mL 1×10⁶CFU/mL溶藻弧菌菌液中分别加入10 mL不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS为阳性对照组。每组设3个平行。溶藻弧菌在28℃、180 r/min摇床振荡培养，分别在0、2、4、6、8 h时各组的每个平行取样1 mL，在4℃、6 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液备用，使用AKP试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)测定上清液在520 nm波长下的吸光值，并按说明书计算各组AKP活性。
1.6电导率测定
测定不同浓度没食子酸在2 h时对溶藻弧菌细胞膜的影响。各组处理方法参照1.5。溶藻弧菌在28℃、180 r/min摇床振荡培养2 h，各组分别取样9 mL，在4℃、6 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，用酶标仪在450 nm波长下测定菌体培养液的电导率。
1.7生物被膜的形成
采用结晶紫染色法测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响。菌液配制方法参照1.3。分别取100μL不同浓度的没食子酸溶液加入到96孔板中，并加入等量的1×10⁶CFU/mL菌液，使没食子酸溶液的终浓度分别为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS为阳性对照组。每组设3个平行。溶藻弧菌在28℃静置培养24 h后，将孔中液体吸出，并用无菌PBS冲洗去除浮游细菌，添加200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的结晶紫溶液，室温静置20 min，吸出结晶紫溶液，无菌蒸馏水冲洗并风干。加入200μL 33%的醋酸溶液溶解，静置15 min后，用酶标仪测定595 nm条件下的吸光值，以33%醋酸溶液为空白对照。
1.8生物被膜的清除
采用结晶紫染色法测定不同浓度没食子酸溶液对成熟生物被膜清除的影响。菌液配制方法如1.3。在96孔板各孔中分别加入200μL 1×10⁶CFU/mL菌液。28℃静置培养24 h后，将孔中液体吸出，并用无菌PBS轻柔冲洗2次，晾干后得到成熟生物被膜。在形成生物被膜的各孔中，分别各添加200μL 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC的没食子酸溶液作为实验组，添加200μL PBS作为对照组。每组设3个平行。28℃静置培养24 h后将孔中液体吸出，并用无菌PBS冲洗2次，200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的结晶紫溶液，室温静置20 min，吸出结晶紫溶液，无菌蒸馏水冲洗并风干。用200μL 33%醋酸溶液溶解，15 min后用酶标仪测定595 nm处的吸光值，以33%醋酸溶液为空白对照。
1.9泳动能力测定
测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌泳动能力的影响。按1.3中的方法配制菌液。配制含浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC没食子酸的0.3%琼脂LB半固体平板。含等量PBS的0.3%琼脂LB半固体平板作为对照组。取2μL 1×10⁶CFU/mL的菌液接种于平板中心，28℃静置培养24 h后，采用十字交叉法测定细菌运动直径大小。
1.10聚集能力测定
测定不同浓度没食子酸对溶藻弧菌的聚集能力的影响。按1.3中的方法配制菌液。实验组为取10 mL 1×10⁶CFU/mL溶藻弧菌菌液，分别加入等量不同浓度的没食子酸溶液，使药物终浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。阳性对照组为在菌液中加入等量PBS。每组设3个平行。28℃培养24 h。待培养结束，在静止状态下，各管分别吸取3 mL菌液测定其在600 nm处的吸光度，再将各管剩余菌液振荡悬浮，测定其在600 nm处的吸光度。计算公式为：
2结果
2.1没食子酸对溶藻弧菌的抑菌作用
采用二倍稀释法和平板计数法测定没食子酸对溶藻弧菌的抑菌效果。实验结果显示，没食子酸对溶藻弧菌的MIC和MBC分别为4 mg/mL和8 mg/mL。
不同浓度的没食子酸对溶藻弧菌生长的影响效果见图1。2MIC和1MIC的没食子酸能完全抑制溶藻弧菌生长，OD值显著低于不加药物的阳性对照组。1/2MIC的没食子酸能显著抑制溶藻弧菌生长，菌株在8 h左右达到平台期，平台期菌液浓度明显低于阳性对照组。1/4MIC的没食子酸对溶藻弧菌生长无明显影响。综上所示，1/2MIC以上浓度的没食子酸对溶藻弧菌生长有良好的抑制作用，且抑制效果随浓度增加逐渐增强。
2.2没食子酸对溶藻弧菌细胞壁完整性的影响
细胞壁是细菌维持形态、保护菌体的重要结构。AKP位于细胞壁和细胞膜之间，在细胞壁未受损时，胞外无法检测到AKP，当细胞壁被破坏受损时，AKP从细胞中漏出，AKP可以作为评价细胞壁通透性的指标。不同浓度没食子酸对溶藻弧菌细胞壁的影响见图2。结果显示，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC处理组的细菌培养液中AKP含量前2 h迅速上升，之后呈逐渐稳定上升的趋势。结果表明，1、2、4、8 mg/mL浓度的没食子酸在2 h内均能破坏溶藻弧菌细胞壁或增加细胞壁的通透性，导致AKP渗出。没食子酸溶液浓度越高、作用时间越长，对溶藻弧菌细胞壁的破坏程度越大。与处理组相比，阳性对照组的AKP含量始终处于较低水平，且无明显变化。其在4~8 h的含量上升，推测可能是细菌正常生命活动过程中的裂解死亡所致。
2.3没食子酸对溶藻弧菌电导率的影响
细胞膜是细菌强有力的保护屏障，而细胞膜的导电性是细胞膜通透性的重要指标，当细菌细胞膜完整性被破坏，渗透性增加，细胞中的Na⁺、K⁺泄漏，导致上清液的电导率变大。不同浓度的没食子酸对溶藻弧菌电导率影响结果见图3。结果显示，1/2MIC、1MIC和2MIC处理组的细菌培养液在2 h时，OD450mm显著高于对照组(P<0.05)；1/4MIC处理组的细菌培养液在2 h时，OD450mm与对照组无显著差异(P＞0.05)。1/2MIC以上浓度的没食子酸可显著增强溶藻弧菌细胞膜的通透性，且其作用强度随没食子酸浓度增加而增强。
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
2.4没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响
生物膜是细菌重要的生存策略，具有抵抗外界环境压力、提供营养支持、促进表面粘附和传导信号等作用。不同浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜形成的影响如图4所示。与阳性对照组相比，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC浓度没食子酸对溶藻弧菌生物被膜的形成均有显著抑制作用(P<0.05)，抑制率分别为16.61%、32.37%、77.80%和83.26%。结果表明，没食子酸能有效抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，抑制作用随其浓度的增加而增强。
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