摘要：【目的】构建牛种布鲁氏菌(B.abortus)A19株效应蛋白BspE基因缺失株，探究其生长特性及在宿主细胞中的生存、黏附及入侵能力，并观察BspE蛋白的亚细胞定位情况。【方法】以牛种布鲁氏菌A19为研究对象，运用同源重组及SacB反向筛选技术构建布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株A19ΔBspE，并通过质粒回补方法构建其回补株A19CΔBspE，比较3种菌株在体外的生长特性；通过平板计数方法分析BspE基因缺失对布鲁氏菌在细胞内的生存及黏附和入侵细胞能力的影响；通过间接免疫荧光试验检测BspE蛋白在RAW264.7细胞中的定位情况。【结果】菌液PCR结果显示，获得大小为2 060 bp的特异性条带，成功构建BspE基因缺失株A19ΔBspE；Western blotting结果显示，获得大小约为14.59 ku的BspE-flag条带，成功构建回补株A19CΔBspE。生长曲线结果显示，在相同的培养条件下，A19ΔBspE与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE的生长趋势没有显著差异(P＞0.05)，均在8 h达对数生长期，32 h进入平台期。胞内增殖试验结果显示，在感染48 h内，A19ΔBspE在RAW264.7细胞中的生存能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE无显著差异(P＞0.05)。细菌黏附和入侵试验结果显示，A19ΔBspE黏附和入侵RAW264.7细胞的能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE没有显著差异(P＞0.05)。间接免疫荧光试验结果显示，BspE蛋白主要分布于核周区域。【结论】本研究证实了BspE基因的缺失不影响布鲁氏菌在体外的生长及在RAW264.7细胞中的生存、黏附及入侵能力，且BspE蛋白主要定位在核周区域，为后续研究布鲁氏菌效应蛋白BspE的生物学功能和致病机制奠定基础。
布鲁氏菌病(brucellosis)是一种由布鲁氏菌引起的人兽共患病，对人类健康及畜牧业的经济发展构成了极大的威胁。目前，布鲁氏菌病的防控主要依靠减毒活疫苗，虽然起到了重要的防控作用，但也存在一些问题，如干扰诊断、残存毒力及孕畜流产等。许多胞内寄生菌通过分泌效应蛋白来促进它们在宿主细胞中的生存和增殖。布鲁氏菌通过分泌多种毒力因子逃避机体的免疫应答，在机体内生存和增殖。IV型分泌系统(type IV secretion system，T4SS)是布鲁氏菌重要的毒力因子，其所分泌的效应蛋白对布鲁氏菌在细胞中的生存和感染后的免疫反应具有调控作用。目前已发现17个与T4SS相关的效应蛋白，分别为VceA、VceC、RicA、BPE005、BPE043、BPE123、BPE275、BtpA、BtpB、SepA、BspA、BspB、BspC、BspE、BspF、BspJ及BspL，它们在布鲁氏菌感染宿主的过程中发挥着重要作用。在这些效应蛋白中，BspE蛋白的功能尚不清楚，从目前的研究分析来看，BspE包含螺旋线圈和跨膜结构域，主要参与形成离散的囊泡，但其在布鲁氏菌感染宿主细胞过程中的作用尚不清楚。为探究效应蛋白BspE的功能和作用，本研究构建牛种布鲁氏菌A19效应蛋白BspE基因缺失株和回补株，研究其对布鲁氏菌体外生长变化及在RAW264.7细胞中生存、黏附和入侵能力的影响，为进一步探究BspE的生物学功能及致病机理奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂
牛种布鲁氏菌A19疫苗株、PUC19-SacB、pET-28a(+)和pBBR1MCS质粒及小鼠巨噬细胞RAW264.7保存于中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病团队重点实验室;Donkey Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®)及Donkey Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor®647)二抗购自Abcam公司;Primer STAR Max Premix购自百奥基生物科技有限公司;ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit、DNA Marker均购自兰州赛维斯生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自兰州博瑞生物科技有限公司;蛋白质分子质量标准、一抗稀释液、ECL Super Kit均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;Anti-DDDDK Tag Antibody购自上海生基生物科技有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG购自甘肃伟博鑫生物科技有限公司。
1.1.2主要仪器
恒温培养箱、电热恒温水槽均购自上海一恒科学仪器有限公司;电泳仪购自北京六一生物科技有限公司;微生物生长曲线分析仪，Bioscreen公司；PCR仪、垂直电泳系统、凝胶成像系统、电穿孔仪均购自Bio-Rad公司;离心机购自Eppendorf公司;生物安全柜购自苏州安泰公司。
相关新闻推荐
2、阐明脓毒症中肠道微生物群和代谢物的组成及其与疾病进展的关系（二）