2.3噬菌体的系统进化地位分析
将Yen-yong1基因组序列上传至NCBI数据库，使用BLASTn(默认参数，2024年9月29日)进行比对。结果显示，与Yen-yong1同源性最高的前39个序列(top hits)均为细菌菌株，提示该噬菌体的祖先与细菌间存在大量基因交换。其中，与小肠结肠炎耶尔森氏菌Y201株(GenBank登录号为CP124238.1)的基因组间的覆盖率和相似度最高(E-value：0.0；percent identity：79.76%；query coverage：35%)。在BLASTn比对中，与Yen-yong1同源性最高的病毒是克雷伯菌噬菌体P85_2(GenBank登录号为OR256025.1)，二者间的相似度为97%(36/37)，但相似区域仅占0.07%(query coverage)。BLASTn初步揭示Yen-yong1的基因组非常新颖，与公共数据库中已公布的病毒间差异较大。
在基于全基因组比对构建的蛋白谱进化树(图3)中，与Yen-yong1进化距离最近的是埃希氏菌噬菌体HK639、坂崎肠杆菌噬菌体phiES15和气单胞菌噬菌体pAEv1818，它们聚成一个支簇(clade)，但Yen-yong1与它们之间的进化距离较远(>0.4)。Yen-yong1与Escherichia phage HK639基因组间的比较图(图4A)也显示其同源性较低。
▲图3 Yersinia phage Yen-yong1的基于全基因组的蛋白进化谱树
▲图4 Yersinia phage Yen-yong1与Escherichia phage HK639的基因组比较(A)和近源噬菌体的VirClust分析结果图(B)
为了进一步阐明Yen-yong1的进化地位，分别计算了Yen-yong1与这3株亲缘关系最近的噬菌体间的平均核苷酸一致性(ANI)和DNA分子原位杂交值(isDDH)(表1)，这些值均小于种内阈值(ANI≥95%，isDDH≥70%)，结果表明Yen-yong1是一个新的种。
▼表1 Yersinia phage Yen-yong1与3株近缘噬菌体之间的ANI、isDDH、PASC和VIRIDIC值
PASC和VIRIDIC分析平台是ICTV推荐用于比对病毒间成对核苷酸序列相似度和成对基因组间相似性的工具。通过PASC对数据库中所有病毒进行扫描比对，结果显示Yen-yong1与其分享的最高PASC值仅为20.64%，最高VIRIDIC值仅为7.30%(表1)，二者均低于ICTV界定属的阈值(≥70.00%)，结果表明Yen-yong1代表一个新的未知属。
将Yen-yong1及在系统进化树(图3)中与其聚成一个支簇(clade)的3个近源噬菌体(HK639、phiES15和pAEv1818)上传至VirClust平台，分析其共享的核心基因。结果显示，Yen-yong1与HK639、pAEv1818和phiES15间共享57个核心基因(图4B)，占它们全部ORFs的20.00%。ICTV关于科和亚科的界定标准为：同一个科的所有病毒至少共享17.00%的核心基因；同一个亚科的所有病毒间共享基因占比为27.00%-79.00%。基于此，Yen-yong1与这3个噬菌体可以归为同一个亚科。它们在蛋白谱系统进化树中与有尾纲Caudoviricetes下Drexlerviridae科的2个噬菌体(Rtpvirus Rtp和Rogunavirus Jk06)共同构成一个更大的支簇，这6个病毒间共享的核心基因占比为14.09%，低于科阈值(17.00%)。此前，HK639和phiES15在国际病毒分类系统中尚未确定分类地位。本研究表明，Yen-yong1与它们共同构建的亚科实际上属于一个以往未知的科。
2.4噬菌体的一步生长曲线
当MOI为1时，噬菌体-菌裂解液中的噬菌体滴度最高，为1.10×1010 PFU/mL(图5A)，因此设定Yen-yong1的最佳MOI为1。以MOI=1绘制的一步生长曲线如图5B所示。Yen-yong1的滴度在感染后即开始增加，但在10-30 min内增量较小，在30-90 min急剧增加，并在90 min达到最高值，此后保持相对稳定。结果表明，Yen-yong1的潜伏期为0-30 min，暴发期为30-90 min，暴发量为406.17 PFU/cell。
▲图5 Yersinia phage Yen-yong1的最佳MOI(A)和一步生长曲线(B)
2.5 pH、盐度、温度敏感性和长期储存与冻融实验
噬菌体的理化稳定性(pH、盐度、温度)是影响其应用潜力的重要因素。Yen-yong1具有宽泛的pH耐受范围(pH 2.0-13.0)，在pH 2.0-11.0时活性较稳定(滴度>109 PFU/mL)，在pH 12.0和pH 13.0时活性下降，但仍具有溶菌活性(分别为3.09×108 PFU/mL和2.19×105 PFU/mL)(图6A)。Yen-yong1在0、1%和3%盐浓度下均保持高溶菌活性，滴度分别为6.76×108、4.47×108和4.17×108 PFU/mL(图6B)。由于CICC 10869在5%、7%和9%盐浓度的平板上无法生长成可见菌苔，因此无法形成可见噬菌斑。
▲图6 Yersinia phage Yen-yong1的理化耐受性和长期储存与冻融结果
在温度耐受实验中，Yen-yong1在-80-40℃的温度范围内处理120 min后，保持稳定高效的溶菌活性(滴度>109 PFU/mL)(图6C)；在50-60℃处理120 min后滴度有所下降，但仍分别保留了2.14×107 PFU/mL和1.38×104 PFU/mL的滴度；在70℃及以上时，噬菌体滴度在30 min内降至0，呈失活状态(图6C)。
在长期储存与冻融实验中，Yen-yong1在-80℃和-20℃下长期保存以及在-20℃反复冻融后，保持稳定高效的溶菌活性(滴度>109 PFU/mL)。在-80℃下长期储存并反复冻融后，虽然滴度有所下降，但在经历13次冻融和360 d的储存后仍高达7.41×108 PFU/mL；在4℃保存360 d后，Yen-yong1噬菌体滴度高达2.46×108 PFU/mL；而在25℃保存330 d后，噬菌体滴度低于检测限，呈失活状态(图6D)。结果显示，将Yen-yong1冻存于-20℃和-80℃均为合适的保存方法，其中在-80℃宜分装后冻存，以减少冻融损伤，而在-20℃下则可反复冻融。
2.6噬菌体对细菌生物被膜的清除作用
采用结晶紫染色法检测了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜形成能力及噬菌体清除细菌生物被膜的效果，结果如图7所示。小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202形成生物被膜的能力均为中等(ODt分别为2.69×ODc、2.70×ODc和2.66×ODc)。噬菌体Yen-yong1对CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜均具有显著的清除作用(P<0.05)。
▲图7小肠结肠炎耶尔森氏菌形成生物被膜的能力及Yersinia phage Yen-yong1对细菌生物被膜的清除能力
2.7噬菌体对生猪肉中病原菌的控制
为模拟猪肉短时摆案销售的污染控制，在25℃将Yen-yong1应用于污染了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生猪肉片上，以评估其在室温条件下对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除效果。如图8A和表2所示，Yen-yong1对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除效果显著，且随着感染复数MOI的提高而增强。在MOI=1、10、100时，3 h内Yen-yong1对CICC 10869的细菌清除率分别为32.20%、92.50%和93.48%。如图8C、8D所示，在MOI=100时，3 h内Yen-yong1对CICC 21669和CMCC 52202的清除率分别为52.77%和43.24%。
▲图8 Yersinia phage Yen-yong1在25℃与4℃对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除率
▼表2 Yersinia phage Yen-yong1对生猪肉片抑菌实验的结果
为模拟猪肉片贮运条件下的污染控制，在4℃将Yen-yong1应用于污染了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生猪肉片上，以评估其在冷藏条件下对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除效果。如图8B和表2所示，在MOI=1、10、100时，噬菌体处理24 h后，所有实验组的小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度均明显低于对照组。Yen-yong1对生猪肉片中的CICC 10869的细菌清除率分别为91.21%、93.95%和98.28%，高于室温下的清除率。如图8C、8D所示，在MOI=100时，Yen-yong1对生猪肉片中的CICC 21669和CMCC 52202的细菌清除率分别为78.35%和96.33%，高于室温下的清除率。
综上所述，Yen-yong1对生猪肉中污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌具有优良的除菌控菌效果，且在冷藏条件下效果更佳。