摘要:提升菌株酸耐受能力在工业生产中有重要经济价值。研究发现，乳酸乳球菌F44中一种功能未知的DeoR/GlpR家族转录因子RdrA与菌株酸耐受能力相关。为研究RdrA对F44菌株耐酸性能的影响，比较rdrA缺陷型、过表达菌株和F44原始菌株的生长曲线、pH曲线、酸耐受、Nisin耐受和Nisin效价,对RdrA的功能进行表征。此外,对rdrA缺陷突变型菌株和F44原始菌株进行转录组学测序,进一步研究RdrA影响F44菌株酸耐受的靶标基因和代谢通路。转录组测序和qPCR结果表明，RdrA主要通过抑制细胞被膜的流动性和韧性,降低胞内蛋氨酸水平,以及抑制DNA分子修复和蛋白修饰过程,降低F44酸耐受能力。研究首次揭示未知功能的转录因子RdrA,为提高乳酸乳球菌耐酸性能提供了新的研究方向和分子靶点，在工业生产中具有重要意义。
乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是一种革兰氏阳性菌，被美国食品和药物管理局(FDA)认定为一般公认安全(GRAs)的微生物，广泛应用于功能性食品工业。
乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸乳球菌发酵产生的一种羊毛硫氨酸细菌素，具有主要针对革兰氏阳性菌的抑菌活性，目前已经广泛应用于食品保鲜行业。Nisin的抑菌机制主要有两种:其一，Nisin通过与细胞壁肽聚糖合成过程中的必需中间体一脂质体II结合，抑制细菌细胞壁合成，使细菌细胞变形死亡;其二，Nisin作用于细胞膜形成孔道，破坏细胞跨膜电位和pH梯度，造成胞内物质流失，使细胞裂解死亡。Nisin生产菌株对Nisin具有特定的保护机制，主要通过ABC转运蛋白(NisFEG)将胞内Nisin排出体外,并通过膜结合脂蛋白(NisI)于胞外结合Nisin形成不溶性复合物，避免细胞膜被Nisin攻击。
由于乳酸乳球菌代谢产酸的特性，酸胁迫是乳酸菌生长过程中面临的主要环境压力。乳酸菌生长的最适环境pH为5.5~6.0，然而随着发酵过程的进行，乳酸逐渐积累使胞内外pH下降，影响胞内多种酶活性，破坏细胞被膜结构，引起细胞死亡。目前，乳酸菌进化出多种耐酸机制，如生物被膜修饰、三磷酸腺苷依赖型质子泵系统、氨基酸脱氨与脱羧系统以及大分子保护与修复等响应酸应激。除此之外，转录因子也能通过影响酸应激相关基因的表达，调节细胞代谢活动，适应环境变化。如乳酸乳球菌F44中PspC家族转录因子YthA参与精氨酸脱亚胺酶(ADI)途径并促进精氨酸生物合成，帮助菌株抵御酸应激并提高Nisin产量。双组份系统转录因子TcsR7上调DLT操纵子转录水平，降低细胞膜内外电势差，提高乳酸乳球菌F44耐酸能力。在乳酸乳球菌CECT8666中，胍胍丁胺通过胍胍丁胺脱亚胺酶水解催化产生腐胺和铵盐来抵抗酸胁迫,同时介导转录因子AguR结合aguB启动子，激活aguBDAC操纵子的转录以提高菌株酸耐受能力。
乳酸乳球菌转录因子RdrA属于DeoR/GlpR家族，该家族主要调控碳水化合物代谢或核苷酸代谢过程,多数情况下通过形成阻遏蛋白抑制相关代谢途径的糖磷酸效应分子，起抑制性转录因子的作用。在大肠杆菌中，DeoR和GlpR分别调节脱氧核糖核酸代谢途径和sn-甘油三磷酸代谢途径的基因表达。近年研究发现，DeoR/GlpR家族转录因子也与环境耐受相关。在单核细胞增生李斯特氏菌中，DeoR家族转录因子FruR是一种果糖操纵子转录抑制蛋白，可以通过诱导磷酸戊糖途径基因表达和抑制糖酵解基因表达来调控单核细胞增生李斯特氏菌的碳代谢，同时产生还原型辅酶II保护菌株响应氧化应激。猪链球菌中GlpR抑制甘油代谢酶基因表达，在抑制甘油利用效率的同时提升猪链球菌抵御氧化应激能力，并且提升菌株在巨噬细胞中的存活率和细胞毒力。耐金属贪铜菌中敲除glpR基因使菌株对高浓度锌胁迫抗性增强。
乳酸乳球菌F44中DeoR/GlpR家族转录因子RdrA的具体功能目前尚未研究。本试验旨在探究转录因子RdrA对乳酸乳球菌酸耐受和Nisin产量的影响，并通过转录组学测序技术寻找RdrA下游调控靶标，探索其基因功能，解析RdrA调控机制，为进一步工程改造乳酸乳球菌奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与设备
1.1.1菌株与试剂
菌株:乳酸乳球菌F44,实验室保藏菌种;敲除rdrA基因的F44菌株,本试验构建菌株,记作DeltardrA;过表达rdrA基因的F44菌株,本试验构建菌株,记作FrdrA。
蔗糖、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、十二水合磷酸氢二钠，上海麦克林生化科技股份有限公司;蛋白胨胨、氯化钠、D-无水葡萄糖、七水合硫酸镁、半胱氨酸、琼脂粉、NisinZ标准品,北京索莱宝科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨胨，英国Oxoid公司;玉米浆，北京奥博星生物技术有限公司;细菌总RNA提取试剂盒DP430，天根生化科技(北京)有限公司;2xSYBRGreenqPCRMix试剂盒,山东思科捷生物技术有限公司。
1.1.2培养基
改良LB培养基:胰蛋白胨胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,D-无水葡萄糖5g/L,调节pH至7.0。
乳酸乳球菌种子培养基:蔗糖15g/L,蛋白胨胨15g/L,酵母粉15g/L,磷酸二氢钾20g/L,氯化钠1.5g/L,七水合硫酸镁0.15g/L,调节pH至7.0。
发酵培养基:在种子培养基的基础上加入3g/L玉米浆和2.6g/L半胱氨酸。
效价培养基:D-无水葡萄糖5g/L,胰蛋白胨胨8g/L,酵母粉2.5g/L,十二水合磷酸氢二钠5g/L,氯化钠5g/L,调节pH至7.2。
以上固体培养基另行加入15g/L琼脂粉。
1.1.3仪器设备
HFsafe-1200LC生物安全柜,香港力康生物医疗科技公司;5200Multi发光成像系统，上海天能生命科学有限公司;UV-1800PC紫外分光光度计,翱艺仪器(上海)有限公司;GL-1908高低温振荡金属浴,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;LightCycler480II实时荧光定量PCR仪，罗氏诊断产品(上海)有限公司。
1.2方法
1.2.1菌株构建
1.2.1.1rdrA过表达菌株构建
使用p124-rdrA-F/R引物扩增F44基因组中rdrA基因,以pLEB124质粒为载体,使用BamHI和HindIII酶切位点连接至载体上。将重组质粒化学转化至大肠杆菌TG1中，提取质粒，将测序正确的重组质粒电转化进入乳酸乳球菌F44中，使用pLEB124-YZ-F/R引物进行菌落PCR并进行琼脂糖凝胶电泳验证。设计引物如表1所示。
表1rdrA过表达菌株构建引物序列
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