1.3革兰氏染色和接触酶试验
用无菌注射器吸取少量MRS肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。染色1min,水洗;滴加革兰氏碘液媒染,作用1min,水洗;30s,水洗;滴加沙黄染色液复染1min，水洗。风干后，在普通光学显微镜上观察，菌体呈红色为阴性，紫色的为阳性。选择革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。具体步骤:取培养物约0.2mL注入装有MRS琼脂培养基斜面，37℃下培养24h，长出菌落后，将3%过氧化氢溶液滴加到菌落上，加琼脂若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。
1.4基因组DNA提取及16S rRNA测序分析
细菌总DNA采用细菌基因组DNA提取试剂盒[Tiangen DP302-02，天根生化(北京)科技有限公司]提取。16S rRNA扩增引物采用细菌通用引物，正向引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物为5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR反应体系(50μL):2μL模板DNA，正、反向引物(10pmol/μL)各2μL，4μL dNTP MIX,5μL Buffer,0.6μL TaKaRa ExTaq酶,用ddH2O将体系补充至50μL。PCR扩增程序:95℃预变性5 min;94℃变性1 min;58℃退火1 min;72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度约1 500 bp的阳性产物经纯化后送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行序列测定。得到的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对，并利用本地软件MEGA-X与模式菌种进行系统进化亲缘关系研究，使用软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.5生理生化试验
生理生化试验包括氧化酶试验、接触酶试验、糖醇发酵试验、淀粉水解试验和乳糖测定试验，均参照《常见细菌系统鉴定手册》中的方法进行。结果分析参考《Microbiology:A Laboratory Manual》和《药品微生物学检验手册》。
1.6生长曲线测定
在锥形瓶内装300 mL MRS肉汤培养基。按1%接种量接种菌株培养物，37℃培养18h，以不加供试菌液的MRS液体培养基为空白对照，每隔1h测定其OD600，记录数据并绘制生长曲线。
1.7抗逆性检测
耐热性能检测:将待测菌株按2%(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，分别于60、70、80℃水浴锅内处理10 min后，37℃培养24 h后，测定其活菌数。
耐酸性能检测:将菌株按2%(v/v)的接种量接种到pH为2.0、2.5、3.0的MRS液体培养基中,分别在0、1、2、3h吸取菌液涂板,37℃培养24h后,测定其活菌数。
耐胆盐检测:将活化好的菌株用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1mL稀释液放于灭菌过的平皿内。然后用含0.3%、1.0%、2.0%牛胆酸钠的MRS固体培养基倾注平板，同时用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基作为对照组，37℃培养48h，进行菌落计数，并计算菌株的存活率。
抗生素抗性检测:将各种抗生素溶解并滤菌后加入到灭菌的MRS培养基中，将菌株按2%(v/v)的接种量接种到含不同含量抗生素的MRS液体培养基中，37℃培养24h，观察其菌落生长情况。试验所用抗生素种类和使用量见表1。
表1抗生素种类和用量
1.8与致病菌混合培养试验
将菌株用MRS肉汤培养基37℃培养24h后，取5mL培养物与15mL营养肉汤混合，接种伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88和O157，接种量为培养液的10%，37℃培养24h，梯度稀释后记录各菌的活菌数。地衣芽孢杆菌采用MRS琼脂培养基计数，各致病菌分别使用各自选择性培养基进行计数，计算各平皿的菌落数，以平均值表示。
1.9抑菌试验
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌O157、伤寒沙门氏菌、化脓杆菌、梅氏弧菌、魏氏梭菌、藤黄球菌、肺炎链球菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和酵母菌株用液体LB培养基37℃培养18h后，进行倍比稀释，取合适稀释度的1mL稀释液倾注培养基，待培养基凝固后将灭菌的不锈钢牛津杯放到各指示菌培养基上，加入地衣芽孢杆菌发酵液无细胞上清液，每个样品3个重复，并设MRS培养液为对照，37℃恒温培养,待出现明显抑菌圈后,测定抑菌圈直径。
1.10统计分析
数据用Excel 2016进行初步整理，采用SPSS22.0软件进行频数统计与描述性分析。
2结果
2.1菌株的鉴定试验
试验以北京市郊区农田土样为材料，
2.2生理生化试验结果
由表2可见，进一步确定筛选出的C30-2菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
表2 C30-2生理试验结果
2.3地衣芽孢杆菌的生长曲线
由图2可见，在培养第5小时，菌株生长进入对数期，此时活菌数开始迅速上升，在第12小时进入稳定期，并于第16小时活菌数达到最大6.6×109 CFU/mL。
2.4地衣芽孢杆菌的抗逆性检测
2.4.1耐热性能检测
由表3可见，在85℃处理10 min后，C30-2的存活率高达93.33%;处理15min，菌株存活率仍有24%。这一结果表明该菌株耐热性能较好。
2.4.2耐酸性能检测
从图3可以看出，pH为3.0和2.5时对地衣芽孢杆菌活性影响较小，而当pH为2.0时活菌数发生明显下降。
2.4.3耐胆盐性能检测
如图4所示，地衣芽孢杆菌C30-2对胆盐具有良好的耐受能力，在各胆盐浓度下培养3h仍可继续生长。
2.4.4抗生素抗性性能检测
地衣芽孢杆菌对喹喹乙醇、乙酰甲喹、速大肥、泰乐菌素、三甲氧苄氨嘧啶、吉他霉素敏感，而对牛至油、洛克沙砷、杆菌肽锌和阿散酸。
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