摘要
抗生素耐药性上升和有效抗病毒药物数量稀少构成了全球公共卫生的重大挑战。本研究聚焦于靶向宿主泛素系统的新型抗感染策略，筛选了39种2-氰基-3-丙烯酰胺类DUB抑制剂，成功鉴定出化合物C6在巨噬细胞中对鼠诺如病毒(MNV-1)和李斯特菌(10403S)展现出显著的抗感染活性。C6表现出较低的细胞毒性（在1.0μM浓度下细胞活力保持80%以上）及优异的药代动力学特性，其在小鼠肝微粒体中的半衰期约为20分钟，静脉注射后在小鼠体内的半衰期约为4小时。这些发现不仅为基于宿主的抗感染治疗提供了新思路，还为开发广谱抗感染药物奠定了重要基础。研究中采用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪进行细菌生长动力学分析，确保了实验数据的精确性和可靠性。
引言
随着抗生素耐药性问题的日益严峻以及有效抗病毒药物的匮乏，寻找新的传染病治疗方法已成为全球医学界的重要课题。近年来，基于宿主的治疗策略逐渐成为药物发现领域的新兴方向。该策略的核心在于通过增强宿主免疫系统对病原体的反应能力，而非直接靶向病原体本身，从而降低病原体快速进化耐药性的风险。在此背景下，泛素-蛋白酶体系统作为真核细胞信号传导的关键调控网络，成为极具潜力的治疗靶点。去泛素化酶（DUB）是这一系统中的重要组成部分，负责去除蛋白质上的泛素标记，进而调节多种细胞过程，包括炎症反应、细胞周期和凋亡等。研究表明，DUB在宿主免疫应答中发挥着关键作用，因此，开发选择性DUB抑制剂有望为传染病治疗提供全新的解决方案。抗生素耐药性与抗病毒药物匮乏推动宿主导向疗法兴起，其通过调控宿主免疫而非直接靶向病原体降低耐药风险。泛素-蛋白酶体系统是关键靶点，去泛素化酶（DUB）调节炎症、细胞周期等免疫相关过程，开发选择性DUB抑制剂为传染病治疗提供新方向。
本研究聚焦于一种新型小分子DUB抑制剂——化合物C6，旨在评估其在巨噬细胞中对两种不同类型的胞内病原体——鼠诺如病毒（MNV）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗感染活性。这两种病原体分别代表了病毒性和细菌性感染，且均能在巨噬细胞内复制，这使得它们成为研究宿主导向疗法的理想模型。MNV是一种无包膜的单链RNA病毒，属于杯状病毒科，是全球范围内引起急性胃肠炎的主要病原体之一，每年在全球范围内造成数以亿计的病例。相比之下，李斯特菌则是一种广泛存在于环境中的革兰氏阳性细菌，可通过污染的食物传播，导致严重的食源性疾病，尤其在老年人、孕妇和免疫功能低下人群中可引发致命的脑膜炎或败血症。尽管这两种病原体在生物学特性上存在显著差异，但它们都依赖于宿主细胞的内部环境进行复制，因此，通过调节宿主细胞的功能来抑制其复制，成为一种潜在的广谱抗感染策略。本研究聚焦新型DUB抑制剂C6，评估其对巨噬细胞内鼠诺如病毒（MNV，病毒性模型）和单核细胞增生李斯特菌（细菌性模型）的抗感染活性。二者均依赖宿主细胞复制，MNV致全球急性胃肠炎，李斯特菌引发高危人群致命性食源性疾病，靶向宿主功能的策略或具广谱抗感染潜力。
为了系统地评估化合物C6的抗感染效果，本研究采用了一系列严谨的实验设计。首先，研究人员构建了一个包含39种小分子DUB抑制剂的化合物库，这些化合物在结构上与已知的先导化合物WP1130及其衍生物G9相关。通过对该化合物库的筛选，研究人员发现化合物C6不仅在细胞培养中表现出显著的抗感染活性，而且其细胞毒性远低于先导化合物G9。更重要的是，化合物C6能够在人和鼠源性巨噬细胞中有效抑制DUB活性，从而减少MNV和李斯特菌的胞内复制。这一发现为开发基于宿主泛素系统的抗感染药物提供了重要的理论依据。此外，代谢稳定性和药代动力学研究表明，化合物C6在小鼠肝微粒体中的半衰期约为20分钟，静脉注射后在小鼠体内的半衰期约为4小时，显示出良好的体内稳定性。这些数据表明，化合物C6不仅具有强大的体外抗感染活性，还具备进一步开发为体内治疗药物的潜力。研究筛选39种与WP1130/G9相关的DUB抑制剂，发现C6抗感染活性显著且细胞毒性低于G9，可抑制人/鼠巨噬细胞DUB活性以减少病原体复制。代谢稳定性显示其小鼠肝微粒体半衰期20分钟，静脉注射体内半衰期4小时，兼具体外活性与体内开发潜力。
本研究的意义不仅在于鉴定了一种具有广谱抗感染活性的新型DUB抑制剂，更在于为宿主导向疗法的发展提供了新的思路。传统的抗菌和抗病毒药物通常直接作用于病原体，容易导致耐药性的产生。而通过靶向宿主细胞的关键调控通路，如泛素-蛋白酶体系统，可以从根本上改变宿主细胞对病原体的易感性，从而实现更为持久和广泛的抗感染效果。此外，化合物C6的成功筛选也为后续药物开发提供了宝贵的参考，尤其是在优化化合物的类药物性质方面。未来的研究将进一步探索C6的具体作用机制，包括其对特定DUB的抑制活性以及对宿主细胞信号通路的影响，以期为开发更安全、更有效的抗感染药物奠定坚实的基础。本研究不仅鉴定了广谱抗感染的C6，更拓展了宿主导向疗法思路。传统药物易致耐药，而靶向泛素-蛋白酶体系统可持久改变宿主对病原体的易感性，为后续药物优化提供参考，未来需进一步探索其作用靶点与信号通路影响。
材料与方法
化合物和试剂。所有化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，分装并在-20°C储存。测试化合物由Evotec Ltd.（英国阿宾顿）或密歇根大学Vahlteich药物化学核心实验室合成，并在补充材料的表S1至S3中显示。化合物通过先前描述的方法合成（49）。所有具有手性中心的化合物都是外消旋混合物。
细胞培养以及细菌和病毒株。RAW 264.7巨噬细胞样细胞系（此处称为RAW）（ATCC TIB-71）在DMEM-10培养基（Gibco DMEM[11995-065]，含4.5 g/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸钠，10%胎牛血清[HyClone]，1%青霉素-链霉素[15140-122;Gibco]，1%HEPES缓冲液[1 M;15630-080;Gibco]，1%非必需氨基酸[100x;11140-050;Gibco]和1%L-谷氨酰胺[200 mM;25030-081;Gibco]）中于37°C和5%CO2的组织培养瓶中维持。纯化克隆的MNV-1（GV/MNV1/2002/USA）MNV-1.CW3（50）（此处称为MNV-1）在所有实验中使用的传代次数为6（如参考文献37所述）。李斯特菌菌株10403S在脑心浸液或LB琼脂平板上培养，或在感染前在液体BHI培养基中生长。
细菌感染试验。将李斯特菌单菌落接种于2 ml BHI液体培养基中，不通气，37°C过夜培养。RAW细胞在24孔板（3524;Costar）中以4×10^5细胞/板的密度在DMEM-10中生长，并在37°C和5%CO2下孵育过夜。为了制备接种物，将BHI中的过夜培养物用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10010-023;Gibco）稀释至10^8 CFU/ml。感染前，培养基更换为含测试化合物指定浓度且无抗生素的温培养基（DMEM-Abx），细胞在37°C和5%CO2下孵育30分钟。然后从细胞中移除含化合物的培养基，更换为含MOI为1（或0.1）的李斯特菌的DMEM，在37°C和5%CO2下孵育30分钟。然后吸出培养基，用温DPBS（含钙和氯化镁）洗涤细胞三次，并向细胞中加入含10μg/ml庆大霉素（和指定测试化合物）的培养基。在指定时间点，移除培养基并更换为1 ml 0.1%Triton X-100，然后刮取细胞，加入3.5 ml蒸馏水，涡旋12秒以裂解RAW细胞。然后向样品中加入PBS（10x），使最终浓度为1×PBS，并在LB琼脂平板上铺板以计数胞内CFU。
细菌生长曲线。为了评估测试化合物对野生型李斯特菌菌株10403S生长的毒性，将细菌培养至600 nm光密度（OD600）为0.5，并在含无DUB抑制剂（未处理）或终浓度为2.5和5.0μM的化合物C6的BHI肉汤中1:10稀释，并在含DMSO（载体对照）的培养基中体积与测试化合物匹配。然后将培养物移至100孔Honeycomb 2板（编号950255）中，每孔300μl，一式三份，在Bioscreen C生长曲线仪器中生长。板在37°C连续中速振荡孵育18小时，并用Prism6软件在线性刻度上绘制。
病毒感染与细菌感染：RAW细胞用化合物预处理30分钟后感染MNV-1(MOI=5)或李斯特菌(MOI=1)。感染后1、4和8小时测定病毒滴度（通过TCID50）或胞内细菌计数（通过菌落形成单位CFU）。细胞活力通过MTT法测定。
代谢稳定性试验：使用小鼠肝微粒体进行代谢稳定性测试，化合物C6在小鼠肝微粒体中的半衰期约为20分钟。反应体系包含0.5 mg/mL肝微粒体、100μM化合物C6和NADPH再生系统，37°C孵育15-60分钟，通过HPLC测定化合物剩余量。
药代动力学研究：化合物C6通过尾静脉或口服给予C57BL/6小鼠（n=6/组），于0.5、1、2、4、6、8、12、24小时采集血浆样本，使用LC-MS/MS检测血浆中化合物浓度，计算药代动力学参数。
细胞毒性评估：在多种细胞处理策略下评估C6的细胞毒性，包括2.5μM预处理后，在1.0μM C6存在下孵育24小时，细胞活力通过MTT法测定。
相关新闻推荐
1、人参外泌体改变巨噬细胞极化状态，抑制非小细胞肺癌细胞的生长的分子机制（一）
2、空气中的微生物主要的种类、来源、影响因素及健康风险（一）
3、测定代表性排放路径等级下噬藻体生长曲线、感染力指标——结果与分析